辛伐他汀联合阿仑膦酸钠对去卵巢骨质疏松大鼠骨代谢的影响

吴琼

胜利油田中心医院关节运动医学科，山东 东营 257000

骨质疏松症(osteoporosis，OP)是一种以骨量减少、骨组织微结构退变破坏、导致骨脆性增加、骨力学强度下降，易于发生骨折为特征的全身性骨骼疾病[1]。OP是老年人普遍存在的健康问题之一，因其常常合并严重并发症，且预后不良，严重危害老年人的健康和生活生存质量。目前防治OP主要有雌激素、选择性雌激素受体调节剂(SERM)、降钙素、双膦酸盐类、甲状旁腺激素(PTH)、氟化物等药物[2]。研究表明他汀类药物具有促进骨形成，抑制骨吸收，抗骨质疏松作用，开启了他汀类药物临床防治OP的新领域[3]。前期研究表明阿仑膦酸钠联合辛伐他汀对去势大鼠骨质疏松起到很好的抗OP作用[4]。本研究探讨应用辛伐他汀联合阿仑膦酸钠对去卵巢骨质疏松症大鼠骨代谢的影响，为防治OP提供价廉有效的治疗模式。

1 材料与方法

1.1 实验材料

清洁级雌性SD大鼠60只，3月龄，体重(330±20) g，订购于北京维通利华实验动物技术有限公司(许可证号：SYXK(京)2018-0035)，辛伐他汀片(舒降之)：(40 mg/片，生产批号：J20181021，美国默沙东制药有限公司)，阿仑膦酸钠片(福善美)(70 mg/片，生产批号：J20180085，美国默沙东制药有限公司)。EXPERT型双能X线骨密度测定仪购于美国LUNAR公司，血清钙(Ca)、磷(P)、碱性磷酸酶(ALP)、骨钙素(BGP)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和过氧化氢酶(CAT)检测试剂盒购于南京建成生物公司；血清抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)、I型胶原羧基末端肽(ICIP)、γ-羧基谷氨酸(GLA)I型前胶原羧基端前肽(PICP)检测试剂盒购于上海谱振生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1实验分组及处理：60只雌性SD大鼠按随机法分为：假手术组、去势组、辛伐他丁组、阿仑膦酸钠组、联合药物组。假手术组仅切除部分脂肪组织，其他4组均行双侧卵巢切除术。造模成功后第2天给予药物干预。假手术组和去势组：(灌胃，等量0.9% Nacl)；辛伐他汀组：辛伐他汀片[灌胃，4 mg/(kg·d)]；阿仑膦酸钠组：阿仑膦酸钠片[灌胃，0.5 mg/(kg·d)]；联合药物组：辛伐他汀片[灌胃，4 mg/(kg·d)]，阿仑膦酸钠片[灌胃，5 mg/(kg·d)]，用药8周。

1.2.2构建去卵巢骨质疏松动物模型：2%戊巴比妥钠腹腔麻醉，腹背部中线第2腰椎水平做长约2 cm双背侧纵行切口，依次分离进入腹腔，沿输卵管寻找卵巢，平镊将卵巢牵出，完整切除双侧卵巢，假手术组仅切除卵巢周围等量脂肪组织，不予切除卵巢和结扎输卵管，术后逐层缝合关闭腹腔。造模成功评价标准：造模8周后骨密度(BMD)峰值减少≥2.5 SD(标准差)。

1.2.3标本取材与处理：药物干预8周，采用快速心脏急性大失血法处死大鼠，取血6～8 mL，高速冷冻离心，3 000 r/min×10 min，收集上层血清1～2 mL，-20 ℃保存备用。逐层剥离L4腰椎和双侧股骨，剔除周围软组织，以无菌生理盐水湿纱布包裹，-20 ℃保存备用。另留取股骨10%甲醛溶液固定，10% EDTA 6周，乙醇梯度脱水，二甲苯透明，制成石蜡切片，保存备用。

1.2.4检测血清骨代谢相关生化指标：取出上清液，采用ELISA法检测各组大鼠血清骨代谢相关生化指标：骨矿化指标：Ca、P；骨形成生化指标：PICP、BGP和ALP；骨吸收生化指标：ICIP、GLA和StrACP，严格按试剂盒说明操作检测血清学指标。

1.2.5检测血清抗氧化应激生化指标：取出上清液，采用ELISA法检测各组大鼠血清抗氧化应激指标：SOD、MDA和CAT，严格按试剂盒说明操作。

1.2.6检测骨组织BMD：取出待测大鼠L4腰椎和右股骨，在LUNAR双能X线吸收扫描仪扫测，采用小物体Discovery Wi扫描模式，用仪器选定兴趣区，以2.0 mm×2.0 mm为中心区域，应用软件分析计算BMD值。

1.2.7HE染色观察股骨形态学：取出石蜡切片，二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化，流水反复冲洗，苏木精染色10 min，流水冲洗，0.5%～1%盐酸酒精分化10 s，流水冲洗30 min，返蓝，蒸馏水洗涤3～5 s；0.5%伊红染液染色2～3 min，流水冲洗；再次脱水、透明，封片，光镜下观察染色并采集图片。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 血清骨矿化生化指标

去势组大鼠血清Ca和P水平较假手术组显著降低(P<0.05)，辛伐他汀组、阿仑膦酸钠组、联合药物组血清Ca和P水平较去势组均升高，以联合用药组升高最显著(P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠血清骨矿化生化指标比较

2.2 血清骨形成生化指标

去势组大鼠血清ALP、BGP、PICP水平较假手术组显著增高(P<0.05)，辛伐他汀组、阿仑膦酸钠组、联合药物组血清ALP、BGP、PICP水平较去势组均降低，以联合用药组降低最显著(P<0.05)。见表2。

2.3 血清骨吸收生化指标

去势组大鼠血清TRAP、GLA、ICIP水平较假手术组显著增高(P<0.05)，辛伐他汀组、阿仑膦酸钠组、联合药物组血清TRAP、GLA、ICIP水平较去势组均降低，以联合用药组降低最显著(P<0.05)。见表3。

表2 各组大鼠血清骨形成生化指标比较Table 2 Comparison of biochemical indicators of serum bone formation among rats in each group

表3 各组大鼠血清骨吸收生化指标比较Table 3 Comparison of serum biochemical markers of bone resorption among rats in each group

2.4 血清氧化应激生化指标

去势组大鼠血清SOD、CAT较假手术组显著降低(P<0.05)，辛伐他汀组、阿仑膦酸钠组、联合药物组较去势组血清SOD、CAT均增高，其中以联合药物组增高最显著(P<0.05)。而去势组大鼠血清MDA较假手术组显著升高(P<0.05)，辛伐他汀组、阿仑膦酸钠组、联合药物组较去势组血清MDA均降低，以联合药物组降低最显著(P<0.05)。见表4。

表4 各组大鼠血清氧化应激指标比较Table 4 Comparison of serum oxidative stress indicators among rats in each group

2.5 骨组织BMD

去势组腰椎和股骨BMD较假手术组显著降低(P<0.05)，辛伐他汀组、阿仑膦酸钠组、联合药物组较去势组腰椎(L4)和股骨BMD和BMC均增高，其中以联合药物组增高最显著(P<0.05)。见表5。

表5 各组大鼠骨组织BMD比较

2.6 骨组织形态学

假手术组股骨组织结构完整，骨小梁致密粗壮，排列整齐，连接网状，脂肪细胞少。去势组股骨组织骨小梁明显减少，稀疏，部分纤细或出现断裂现象，连接不完整，大量纤维组织，髓腔内大量空泡状脂肪细胞。辛伐他汀组和阿仑膦酸钠组骨小梁数量增多，排列尚规则，网状结构略微修复，结构仍不完整，脂肪细胞变少。联合药物组骨组织结构较完整，骨小梁数目明显增多，粗细均匀致密，立体网状结构，脂肪细胞明显减少。见图1。

图1 HE染色观察股骨形态结构变化(×200) A：假手术组；B：去势组；C：辛伐他汀组；D：阿仑膦酸钠组；E：联合药物组Fig.1 HE staining observation of morphological changes of the femurs (×200). A: Sham operation group; B: Castration group; C: Simvastatin group; D: Alendronate group; E: Combination group

3 讨论

OP是严重危害中老年人身体健康的一种疾病，较常见于绝经后妇女，临床表现：①骨量减少，如骨矿物质、骨基质等减少。②骨组织微结构退变，骨小梁数目减少，结构破坏、变细变薄和断裂。③骨组织生物力学改变(如骨力学强度下降、载荷承受力降低、骨脆性增高)，骨折危险性增加易于发生骨折[5]。目前防治OP的药物种类繁多，作用特点不同，但在疗效、副作用和安全性等方面存在很多问题[6]。雌激素替代疗法(hormone replacement therapy，HRT)目前已普遍应用于防治OP，但长期HRT会增加乳腺癌、子宫内膜癌、静脉血栓及阴道出血的发生率[7]。因此，寻找防治骨质疏松的联合用药对改善OP预后有重大意义。

他汀类药物属3-羟基3-甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)抑制剂，具有刺激成骨细胞分化，促进骨形成，增加骨密度，恢复微结构，增加其强度，减少骨折危险等作用[8-9]。辛伐他汀通过多条途径既能促进骨形成，又抑制骨吸收，从而发挥抗骨质疏松的作用。其主要作用机制：①促进骨形成：通过促进骨形态发生蛋-2(bone morphogenetic protein-2，BMP-2)基因表达，增强ALP和骨钙素(osteocalcin，OC)的活性，促进成骨细胞分化，骨基质形成和矿化过程，介导骨形成；诱导间充质干细胞分化为成骨细胞，发挥强大的成骨作用，增加骨量，修复骨微结构[10]。②抑制骨吸收：抑制胆固醇合成HMG-CoA还原酶抑制破骨细胞的作用，其与二膦酸盐作用于同一路径的不同位点，抑制破骨细胞功能，抑制骨吸收[11]。

阿仑膦酸钠属第三代二膦酸盐(Bisphosphonates，BPs)类药物，具有强力抑制骨吸收、降低骨转换、预防骨量丢失、增加骨量和减少骨折发生的作用，是首个以骨质疏松为适应证而获准上市的BPs[12]。阿仑膦酸钠可直接结合破骨细胞膜表面的ATP类似物，抑制ATP-依赖性细胞内酶，抑制破骨细胞的骨吸收功能，影响其分化和活性，进而使其凋亡，抑制骨吸收、降低骨转换率[13]。且阿仑膦酸钠对成骨细胞无作用，故不影响骨形成和骨矿化，骨质仍正常。

Ca、P、ALP、BGP、PICP、TRAP、GLA、ICIP等骨代谢相关指标作为评价判断骨形成、骨吸收和骨转换的常用指标，与BMD相结合，有利于OP的诊断、治疗及病情评估。SOD、MDA和CAT是体内重要的抗氧化酶，能够有效清除过氧化产生各种活性自由基，减轻氧化应激损伤。同时研究证实氧化应激也是OP的重要发病机制[14]。他汀类和双膦酸盐类药物可共同作用于甲羟戊酸途径，通过抑制HMG-CoA还原酶发挥抑制破骨细胞的作用[15]。本研究证明辛伐他汀、阿仑膦酸钠联合干预可调节去卵巢大鼠骨质疏松骨代谢，抗氧化应激反应，增加骨密度，改善骨组织结构，具有较好的抗骨质疏松作用。同样，许大勇等[4]研究表明阿仑膦酸钠、辛伐他汀两药联合具有协同抗骨质疏松作用。严鹏霄[16]研究表明阿仑膦酸钠联合辛伐他汀可改善骨生化指标，联合应用有更明显的防治OP作用。邓训训等[17]研究表明阿托伐他汀联合阿仑膦酸钠能有效提高高龄骨质疏松改善骨代谢，增加骨密度。

综上所述，辛伐他汀联合阿仑膦酸钠可调节骨质疏松大鼠骨代谢，抗氧化应激，增加骨密度，改善骨组织结构，具有抗骨质疏松作用。目前两药防治OP的效果是肯定的，有着不可忽视的作用。但是，他汀类和二膦酸盐药物对骨代谢的具体作用分子机制尚未完全明确，可能还有尚未认知的抗骨质疏松的作用机制有待于进一步研究。