血清25-(OH)D水平及VDR基因多态性与类风湿性关节炎骨侵蚀的关系探讨

魏巍 张伟 吴国志 陈荣

海南医学院第二附属医院，570311

类风湿性关节炎是以炎性滑膜炎反应为主的系统性、自身免疫性疾病，常可在发病2年内出现骨关节破坏，导致患者残疾，严重影响日常生活[1]。维生素D是一种类固醇衍生物，其通过与维生素D受体(vitamin D receptor，VDR)相结合，可参与机体钙磷代谢及骨盐沉积，并可作用于机体免疫系统，影响多种细胞增殖及分化，参与免疫调节[2]。25-羟维生素D[25-(OH)D]是维生素D中间代谢产物，被认为是反映维生素D水平的一个最可靠指标[3]。VDR广泛分布于机体各组织细胞中，其可参与骨代谢及免疫调节反应。有研究发现[4]，参与骨代谢的VDR基因单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)位点主要为FokI、BsmI及ApaI等。类风湿性关节炎发病机制复杂。有研究表明[5]，维生素D缺乏可加速类风湿性关节炎产生及恶化。但目前国内关于维生素D水平及其受体基因多态性与类风湿性关节炎骨侵蚀关系的研究尚少，基于此，本研究通过检测类风湿性关节炎患者血清25-(OH)D水平及VDR基因多态性，并分析其与骨侵蚀的相关性，以期为临床治疗提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料

将本院2014年7月至2018年6月收治的94例类风湿性关节炎患者设为研究组，另将85例同期体检健康者设为健康组。其中研究组男35例，女59例，汉族，年龄34～62岁，平均(46.28±7.21)岁，病程4～32个月，平均(20.12±3.34)个月，受累关节数5～23个，平均(14.26±2.13)个，改良28关节疾病活动性评分(DAS28)[6]3.89～5.96分，平均(5.35±0.38)分；健康组男34例，女51例，汉族，年龄32～65岁，平均(47.93±7.45)岁。2组受试者在民族、性别及年龄方面差异无统计学意义(P>0.05)，且本研究获得医院伦理委员会批准。

纳入标准：研究组均符合类风湿性关节炎诊断标准[7]，均经X线检查；近3个月内均未接受维生素D类似物治疗；所有受试者均知情同意，且均为汉族。

排除标准：合并骨质疏松以及其他与骨侵蚀有关疾病者；肿瘤、感染等引起关节疼痛者；不能正常饮食或不能接受户外阳光照射者；存在血缘关系者。

1.2 方法

1.2.1血清25-(OH)D水平检测：均抽取受试者清晨空腹静脉血3 mL，离心，分离血清，采用酶联免疫吸附试验法检测血清25-(OH)D水平(试剂盒购于英国艾迪斯公司)，所有步骤严格按照说明书执行。

1.2.2VDR基因多态性检测：⑴血样DNA提取：采集受试者静脉血4 mL，根据Wizard Genonic DNA purification Kit(Promega公司)试剂盒说明书进行操作，提取DNA并经分光光度计定量及琼脂糖凝胶电泳质检；⑵引物设计与合成：选择3个VDR基因SNPs位点，即FokI(rs2228570)位点、BsmI(rs154410)位点、ApaI(rs7975232)位点，参照Mosaad等[9]设计的用于VDR基因扩增引物，由北京奥科生物公司合成；⑶基因型检测：采用MassARRAY分子量阵列技术平台，通过引物延伸或切割反应与MALDI-TOF质谱技术相结合，而对所选VDR基因SNPs位点分型进行检测，获得分型结果。

1.2.3骨侵蚀分期：根据经双手X线片检查分期(任意一个受累关节)[8]，Ⅰ期：无骨质破坏性改变或关节端骨质疏松；Ⅱ期：骨质疏松、可有轻度软骨破坏、伴或不伴轻度软骨下骨质破坏，可伴有关节活动受限但无关节畸形等；Ⅲ期：骨质疏松伴软骨破坏，明显关节软骨下囊样破坏，关节半脱位，关节间隙狭窄等；Ⅳ期：除了包含Ⅱ、Ⅲ期内容外，且有纤维性或骨性强直；其中Ⅰ期与Ⅱ期归为无骨侵蚀(25例)，Ⅲ期与Ⅳ期归为有骨侵蚀(69例)。

1.3 观察指标

研究组与健康组血清25-(OH)D水平：其中<20 ng/mL记为缺乏，≥20 ng/mL且<30 ng/mL记为不足，≥30 ng/mL且≤100 ng/mL记为正常。研究组骨侵蚀者与无骨侵蚀者血清25-(OH)D水平。研究组与健康组基因型、等位基因分布：缺乏内切酶FokI、BsmI、ApaI酶切位点用F、A、B表示，存在酶切位点用f、a、b表示。研究组骨侵蚀者与无骨侵蚀者基因型、等位基因分布。

1.4 统计学方法

采用SPSS 25.0统计学软件对数据进行分析，两样本计量资料与计数资料分别采用t检与χ2检验，血清25-(OH)D水平、VDR基因多态性与骨侵蚀关系探讨采用Logistic多元逐步回归模型进行分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 研究组与健康组血清25-(OH)D水平比较

研究组血清25-(OH)D水平明显低于健康组(P<0.05)，见表1。

2.2 研究组骨侵蚀与无骨侵蚀者血清25-(OH)D水平比较

研究组骨侵蚀患者血清25-(OH)D水平明显低于无骨侵蚀者(P<0.05)，见表2。

表1 研究组与健康组血清25-(OH)D水平对比

表2 研究组骨侵蚀与无骨侵蚀者血清25-(OH)D水平对比

2.3 研究组与健康组基因型、等位基因分布比较

研究组BsmI位点基因型频率及等位基因B频率与健康组比较差异均无统计学意义(P>0.05)，研究组FokI位点基因型FF、Ff及等位基因F占比均明显高于健康组(P<0.05)，研究组FokI位点基因型ff占比明显低于健康组(P<0.05)，研究组ApaI位点基因型AA、Aa及等位基因A占比均明显高于健康组(P<0.05)，研究组ApaI位点基因型aa占比明显低于健康组(P<0.05)，见表3。

表3 各位点基因型和等位基因分布Table 3 Genotype and allele distribution of each locus

续表3 各位点基因型和等位基因分布

2.4 研究组骨侵蚀与无骨侵蚀者基因型、等位基因分布比较

研究组骨侵蚀患者FokI位点、ApaI位点、BsmI位点基因型出现频率与无骨侵蚀患者差异无统计学意义(P>0.05)，研究组骨侵蚀患者FokI位点、ApaI位点、BsmI位点的等位基因F、B、A出现频率与无骨侵蚀患者差异无统计学意义(P>0.05)，见表4。

表4 骨侵蚀与无骨侵蚀者各位点基因型和等位基因分布

续表4 骨侵蚀与无骨侵蚀者各位点基因型和等位基因分布

2.5 血清25-(OH)D水平、VDR基因不同SNPs位点基因型与类风湿性关节炎的关系

经Logistic多元逐步回归模型分析发现，血清25-(OH)D<30 ng/mL、FokI位点基因型FF及Ff、ApaI位点基因型AA及Aa均是类风湿性关节炎发病的危险因素(OR=5.149、4.267、3.013、5.234、5.097，P<0.05)，BsmI位点基因型BB及Bb与类风湿性关节炎发病无明显关系(OR=1.006、1.002，P>0.05)，见表5。

表5 血清25-(OH)D水平、VDR基因不同SNPs位点基因型与类风湿性关节炎的关系

2.6 血清25-(OH)D水平、VDR基因不同SNPs位点基因型与类风湿性关节炎骨侵蚀的关系

经Logistic多元逐步回归模型分析发现，血清25-(OH)D<20 ng/mL是类风湿性关节炎骨侵蚀的危险因素(OR=3.987，P<0.05)，FokI位点基因型FF及Ff、BsmI位点基因型BB及Bb、ApaI位点基因型AA及Aa均与类风湿性关节炎骨侵蚀无明显关系(OR=1.007、1.009、1.003、1.001、1.011、1.012，P>0.05)，见表6。

表6 血清25-(OH)D水平、VDR基因不同SNPs位点基因型与类风湿性关节炎骨侵蚀的关系

3 讨论

类风湿性关节炎的发病可能与遗传、多种免疫因素等有关，其病理变化主要为间质大量炎性细胞浸润、滑膜衬里细胞增生以及骨和软骨组织破坏等[10]。骨侵蚀患者的骨关节损伤不可逆，故早期诊断及干预极其重要。X线检查是临床诊断类风湿性关节炎骨侵蚀的常用手段，但经X线检查显示异常者多已出现不可逆骨关节破坏，严重影响疾病恢复[11]。

本研究发现，研究组血清25-(OH)D水平低于健康组(P<0.05)，且骨侵蚀患者低于无骨侵蚀者(P<0.05)。另分析发现血清25-(OH)D<30 ng/mL是类风湿性关节炎发病的危险因素，血清25-(OH)D<20 ng/mL是类风湿性关节炎骨侵蚀的危险因素，提示类风湿性关节炎患者血清25-(OH)D水平降低，且在伴骨侵蚀患者中降低更加明显，血清25-(OH)D水平缺乏可增加骨侵蚀发生风险。维生素D是骨正常钙化及矿物质代谢所必需的，可促进骨形成，而血清25-(OH)D是维生素D的活性形式，其水平的降低表明维生素D减少[11]。有研究显示[12]，T、B淋巴细胞以及其相关细胞因子在类风湿性关节炎发生发展中发挥重要作用。维生素D是抑制胸腺基质树突状细胞分化成熟的主要因子，可直接作用于Th1、Th2及Th17细胞，减少炎性细胞因子分泌，并促进抗炎细胞合成[14]。因此，维生素D既可改善关节骨质破坏，亦具有免疫抑制作用。当25-(OH)D水平降低，则维生素D调节骨骼及钙磷代谢作用减弱，影响关节骨质破损的修复，且免疫抑制功能下降，炎性反应加重，则病情进一步发展，关节损伤程度加重[15]。有研究发现[16]，类风湿性关节炎患者血清25-(OH)D水平越低，其关节破坏程度越严重，此与本研究结果相符合。因此，类风湿性关节炎患者血清25-(OH)D水平减低，且其缺乏可增加骨侵蚀发生风险。

本研究还发现，研究组FokI位点基因型FF、Ff与等位基因F以及ApaI位点基因型AA、Aa与等位基因A频率均明显高于健康组(P<0.05)，研究组基因型ff、aa占比均明显低于健康组(P<0.05)，且分析发现FokI位点基因型FF及Ff、ApaI位点基因型AA及Aa均是类风湿性关节炎发病的危险因素，提示类风湿性关节炎发病可能与VDR基因FokI位点等位基因F、ApaI位点等位基因A有关。基因多态性可改变VDR mRNA表达水平，进而在转录水平上影响VDR蛋白表达，促使VDR蛋白在数量及活力上出现不同，影响维生素D发挥效应[17]。VDR是糖皮质激素、甲状腺激素等受体基因超家族成员，存在多个SNPs位点，不同基因型的VDR可对维生素D产生不同的生物效应[18]。本研究还发现，研究组骨侵蚀患者FokI位点、ApaI位点、BsmI位点基因型等级分布及等位基因出现频率均与无骨侵蚀患者差异无统计学意义(P>0.05)，且分析发现其均与类风湿性关节炎骨侵蚀无明显关系，提示VDR基因多态性与类风湿性关节炎骨侵蚀的发生风险无关。

综上，类风湿性关节炎患者血清25-(OH)D水平降低，且其缺乏可增加类风湿性关节炎骨侵蚀发生风险，另VDR基因FokI位点等位基因F及ApaI位点等位基因A虽可增加类风湿性关节炎发病风险，但与骨侵蚀无关。临床工作者需及早监测类风湿性关节炎患者血清25-(OH)D水平并适时补充维生素D，另需提高对含VDR基因FokI位点等位基因F及ApaI位点等位基因A者的警惕。但本研究样本量较小，可能会导致实验结果出现偏差，后续需扩大样本量进行相关性研究。