利用酵母双杂交技术筛选鉴定与番茄环纹斑点病毒NSs蛋白互作的西花蓟马蛋白

赵星月, 陈建斌, 王曙光, 张晓林, 穆 野, 魏 辉, 赵立华, 陈永对, 郑 雪, 陈 勇, 郑立敏,*, 张 洁,*

(1. 西南林业大学生命科学学院, 昆明 650224; 2. 云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所, 云南省农业生物技术重点实验室, 农业部西南作物基因资源与种质创制重点实验室, 昆明 650205; 3. 湖南省农业科学院植物保护研究所, 长沙 410125; 4. 福建省农业科学院植物保护研究所, 福建省作物有害生物监测与治理重点实验室, 农业部福州作物有害生物科学观测试验站, 福州 350003)

番茄环纹斑点病毒(tomato zonate spot virus, TZSV)是在云南省发现的布尼亚病毒科(Bunyaviridae)番茄斑萎病毒属Orthotospovirus暂定种，该病毒侵染危害烟草Nicotianatabacum、番茄Lycopersiconesculentum、辣椒Capsicumannuum和花卉等重要经济作物，近年来有向云南周边地区扩散蔓延的趋势(Dongetal., 2008)。TZSV侵染寄主植株后，呈现出典型的番茄斑萎病毒属细胞病理特征，病毒粒子分布于感染植物细胞的细胞质中，呈球形，由一层糖蛋白膜包裹，病毒粒子相对较大，直径约85 nm，单个或多个病毒粒子聚集于囊泡内。植物感染该病毒后，新叶首先出现黄色同心环纹或环形带状褪绿斑点，之后由黄斑转变为枯斑，叶片出现黄化、凋零，造成整叶或半叶呈红褐色坏死。感病植株还会出现矮化、顶芽萎蔫下垂、叶片皱缩褪绿等症状(Dongetal., 2008; 赵绕芬和王小兵, 2012)。虽然近年来许多学者对TZSV的病原生物学进行了广泛的研究，明确了病毒的地理分布、症状、病原性质、细胞病理学等诸多问题，但对TZSV编码蛋白与寄主植物和介体昆虫蛋白互作机制仍然知之甚少，尤其对该病毒在植物体内的复制增殖、运动、致病等作用机制以及与寄主互作相关研究欠缺。

TZSV病毒是一种RNA病毒，其基因组由3条RNA链组成，即ssRNA-L, ssRNA-M和ssRNA-S(Elliot, 1990; Germanetal., 1992)。其中，ssRNA-L是反向负义链，编码依赖RNA的RNA聚合酶(RdRP)(de Haanetal., 1991)；早在20世纪70年代，RdRP就在病毒中被发现，大多数的RNA病毒都编码RdRP，主要参与病毒基因组的复制、mRNA合成、RNA重组等过程。RdRP在病毒复制中起着至关重要的作用。ssRNA-M编码非结构蛋白NSm(Kormelinketal., 1993)；由RNA-M正义链编码的非结构蛋白NSm是唯一一种布尼亚病毒科其他动物病毒所不能编码的蛋白，被认为是Orthotospovirus适应植物的结果(Lietal., 2009)。Kormelink等(1994)首次提取和纯化了NSm，利用免疫标记等方法证明了NSm参与了病毒的胞间运动(cell-to-cell movement)。ssRNA-S编码非结构蛋白NSs(de Haanetal., 1990)。TZSV主要由蓟马以持久增殖型方式传播。本课题组前期调查发现，在TZSV感染作物发病区，西花蓟马Franiklinellaocicdentalis为优势种群，此外还发现有棕榈蓟马Franiklinellapalmi和梳缺花蓟马Franiklinellashculetzi(尹跃艳等, 2008; 郑雪等, 2015)。

NSs是ssRNA正链编码的非结构蛋白，最初被认为是病毒的致病因子，该蛋白在植物体内表达能够增强病症表型(Kormelinketal., 1991)。Takeda等(2002)首次用农杆菌共浸润实验证实了番茄斑萎病毒(tomato spotted wilt virus, TSWV)NSs蛋白为基因沉默抑制子。近年来的研究显示NSs可能在病毒复制、转录过程中起重要作用(Oliveiraetal., 2011; Margariaetal., 2014)。而关于TZSV NSs在病毒与介体昆虫互作中发挥的具体功能和机制尚不清楚。本研究利用酵母双杂交系统，以TZSV非结构蛋白NSs为诱饵蛋白，筛选西花蓟马体内与NSs互作的介体蛋白。通过对互作介体因子进行生物信息学分析，推测其在病毒与介体昆虫互作过程中可能具有的生物学功能，为深入了解TZSV致病特征及病原与介体昆虫的互作机制提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

本实验室感染TZSV和TSWV毒株采自云南元谋，经分离纯化获得的病毒汁液摩擦接种到本氏烟Nicotianabenthamiana，感病植株叶片保存于超低温冰箱作为毒源。西花蓟马的cDNA文库由湖南省农业科学院植物保护研究所馈赠。大肠杆菌EscherichiacoliDH5α为本实验室保存。克隆载体pEASY-T1、TransStart®TopTaqDNA聚合酶、High Pure dNTPs、10×Taq Buffer和琼脂糖等试剂购自TransGen Biotech有限公司；质粒小提试剂盒、酵母质粒提取试剂盒、溶壁酶购自天根生化科技(北京)有限公司；TRIzol购自Invitrogen公司；反转录试剂HiScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit购自Vazyme Biotech有限公司；DNA限制性内切酶、营养缺陷型培养基、无氨基氮源、YeastmakerTMCarrier DNA Denatured、T4 DNA连接酶、酵母菌株AH109、pGADT7和pGBKT7质粒等试剂购自宝生物工程(大连)有限公司；胰蛋白胨和酵母提取物购自Oxoid公司；葡萄糖、二甲基亚砜(DMSO)、聚乙二醇(PEG)、醋酸锂(LiAc)、X-α-Gal等试剂购自Sigma公司；琼脂粉购自Difco公司；其余试剂为国产分析纯(A.R.)。

1.2 酵母双杂交诱饵质粒的构建

将1.1节约0.1 g感染了TZSV的本氏烟样品在液氮中充分研磨成粉末，迅速转移至液氮冷冻过的1.5 mL离心管中，加入1 mL Trizol，剧烈震荡混匀，然后参考Invitrogen公司Trizol试剂的操作方法提取总RNA；根据GenBank已登录的TZSVNSs(GenBank登录号: KC133530.1)序列设计用于PCR扩增TZSVNSs的特异引物，并根据酵母表达载体构建的要求，在上游引物和下游引物分别加入特定的酶切位点NdeⅠ和BamHⅠ(表1)，引物序列见表1。以提取的总RNA为模板，NSs基因对应的3′端下游引物NSs-R进行反转录合成cDNA，反应体系: RNA 2 μg, NSs-R引物(2 μmol/L)1 μL, ddH2O至8 μL。反应条件: 65℃加热5 min，放置于冰上静置2 min，加入2×RT Mix 10 μL, HiScript® Enzyme Mix 2 μL, 50℃反应1 h，85℃灭活5 min，冰上放置即为获得的cDNA模板。最后以cDNA为模板，利用NSs基因的引物(NSs-F/NSs-R)进行PCR扩增获得目的基因，反应体系(50 μL): 10×buffer 5.0 μL,TopTaqDNA聚合酶 1.0 μL, dNTP Mix 4.0 μL, NSs-F和NSs-R(2 μmol/L)各1.0 μL, cDNA模板5.0 μL, ddH2O 33.0 μL。反应程序: 95℃预变性5 min; 95℃变性30 s, 58℃退火30 s, 72℃延伸1.5 min, 共30个循环; 72℃延伸10 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，进行胶回收并纯化。将PCR产物割胶回收后与克隆载体pEASY-T1连接，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布于含有50 μg/mL氨苄青霉素LB平板，菌落PCR及序列测定获得阳性克隆，命名为pEASY-NSs。用NdeⅠ和BamHⅠ分别消化重组质粒pEASY-NSs及pGBKT7载体质粒，纯化回收后，T4 DNA连接酶连接，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，卡那霉素抗性平板筛选诱饵载体阳性克隆，菌落PCR和酶切鉴定获得诱饵载体的阳性克隆，命名为pGBKT7-NSs。将上述获得的质粒送往擎科生物技术有限公司进行测序，并通过NCBI网站的BLAST对测序结果进行比对，将测序结果完全正确的重组质粒扩大培养并保存备用。

1.3 酵母双杂交诱饵载体的毒性和自激活检测

采用醋酸锂法将诱饵表达载体pGBKT7-NSs、空载体pGBKT7(阴性对照组)分别转化至酵母感受态细胞AH109，并涂布于SD/-Trp上，30℃下倒置培养2～3 d后，观察菌落生长情况。同样采用醋酸锂法将阳性对照(pGBKT7-53/pGADT7-T)、阴性对照(pGBKT7-Lam/pGADT7-T)以及pGBKT7-NSs/pGADT7-T分别转化至酵母细胞AH109内，并涂布于SD/-Trp/-Leu培养基上，30℃下倒置培养2～3 d后，选取单克隆划线于SD/-His/-Leu/-Trp/-Ade/X-α-Gal和SD/-His/-Leu/-Trp/-Ade和SD/-Trp/-Leu营养缺陷型培养基上，30℃下倒置培养2～3 d，观察并比较酵母菌落的生长状态和颜色变化,判断NSs蛋白对酵母AH109细胞是否有毒性和自激活活性。

1.4 酵母双杂交顺序转化筛选与NSs互作的蛋白和生物信息学分析

采用顺序转化法筛选西花蓟马cDNA文库中与NSs互作的蛋白。将pGBKT7-NSs转化至酵母AH109后，以含有pGBKT7-NSs的AH109酵母菌制备感受态细胞。将西花蓟马的cDNA文库质粒转化至含有pGBKT7-NSs的AH109酵母菌感受态细胞中，涂布于含有2.5 mmol/L 3氨基-1,2,4三氮唑(3-AT)的筛选培养基SD/-His/-Leu/-Trp上，30℃倒置培养3～5 d后，挑取SD/-His/-Leu/-Trp+3-AT平板上生长的单菌落，接种于SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal平板培养3～5 d，观察酵母的生长及显色情况。

挑取SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal平板上的阳性菌落，加入到含有氨苄青霉素的液体SD/-Trp/-Leu培养基中，置于30℃, 220 r/min摇床培养24 h，参考酵母质粒小量提取试剂盒说明书提取质粒。以质粒为模板，pGADT7载体通用引物见表1。进行PCR扩增反应，分析pGADT7载体中插入片段的大小并排除重复克隆。舍弃插入片段小于500 bp的质粒，其余转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，送交公司测序。根据序列信息分析插入片段序列，参照NCBI数据库进行BLAST分析，找到同源序列，统计序列长度、基因登录号、基因注释、读码框完整性、读码框一致性等信息，初步筛选出与NSs互作的介体蛋白。

1.5 酵母细胞内回转验证TZSV NSs与介体蛋白候选因子的相互作用

将类电压依赖性阴离子通道(voltage-dependent anion-selective channel-like, VDAC)全长基因序列构建至pGADT7载体进行互作验证。根据GenBank已登录的西花蓟马VDAC(GenBank登录号: XM_026416489.1)序列设计VDAC的特异引物，并根据酵母表达载体构建的要求，在上游引物和下游引物分别加入特定的酶切位点NdeⅠ和BamHⅠ，引物序列见表1。取约20头西花蓟马，提取其总RNA，并以VDAC-R为特异性引物进行反转录，获得西花蓟马cDNA模板(RNA提取和反转录过程参考1.2节)。以VDAC-F/VDAC-R为引物，PCR扩增VDAC基因，反应体系和反应程序同1.2节。将扩增并纯化的VDAC基因扩增序列克隆到pEASY-T1载体上，经NdeⅠ和BamHⅠ双酶切后连接到酵母表达载体pGADT7，获得酵母重组表达载体pGADT7-VDAC。

将pGBKT7-NSs和候选因子pGADT7-VDAC共转化至酵母AH109感受态细胞，涂布于SD/-Trp/-Leu平板，30℃下倒置培养，直至克隆菌落出现，牙签蘸取SD/-Trp/-Leu平板上生长的单菌落，置于20 μL ddH2O中，即为初始菌液浓度100，按4个浓度梯度(10-1, 10-2, 10-3和10-4)对初始菌液进行稀释，分别接种于SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade平板，同时设置阳性对照组(pGBKT7-p53/pGADT7-T)、阴性对照组(pGBKT7-Lam/pGADT7-T)、空载体共转化对照组(pGADT7/pGBKT7)以及质粒与空载体共转化对照组(pGBKT7-NSs/pGADT7； pGADT7-VDAC/pGBKT7)。30℃倒置培养3～5 d后，观察酵母的生长情况。

1.6 pGEX-4T-1-VDAC和pDEST17-NSs原核表达载体的构建

根据GenBank已登录的西花蓟马VDAC(GenBank登录号: XM_026416489.1)序列设计VDAC基因引物，如表1所示。以1.5节中获得的西花蓟马cDNA为模板为模板，PCR扩增VDAC基因，反应体系和反应程序同1.2节。将扩增并纯化的VDAC基因扩增序列克隆到pEASY-T1载体上，经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后连接到pGEX-4T-1(带有GST标签蛋白)表达载体，获得与GST融合的VDAC原核表达载体pGEX4T-1-VDAC。

利用Gateway技术构建重组质粒pDEST17-NSs，设计引物如表1所示。以GW-TZSV-NSs-F/GW-TZSV-NSs-R为引物，以1.2节合成的感染了TZSV的本氏烟样品cDNA为模板，PCR扩增TZSV NSs基因并纯化回收，PCR反应体系和反应条件同1.2节。根据TSWV NSs基因序列(GenBank登录号: JF960235.1)，设计TSWV NSs引物，引物见表1。提取感染TSWV植株总RNA，以GW-TSWV-NSs-R为特异性引物，反转录获得cDNA(方法同1.2节)，以GW-TSWV-NSs-F/GW-TSWV-NSs-R为引物，PCR扩增TSWV NSs基因并纯化回收， PCR反应体系和反应条件同1.2节。

表1 引物信息Table 1 Primers used in this study

将上述TSWV NSs和TZSV NSs基因的PCR回收产物分别与pDONR221混合进行BP重组反应，反应体系: PCR产物1.5 μL, pDONR221质粒0.5 μL, BP重组酶0.5 μL，充分混匀后离心，置于25℃金属浴中反应1 h，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，分别获得来源于TZSV和TSWV的重组入门质粒载体pDONR221-NSs，并与原核表达载体pDEST17(带有His标签)进行LR重组反应，反应体系: pDONR221-NSs质粒0.5 μL, pDEST17质粒0.5 μL, BP重组酶0.5 μL, ddH2O 1 μL, 充分混匀后离心， 置于25℃金属浴中反应过夜，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，分别获得来源于TZSV和TSWV的重组质粒pDEST17-NSs。重组质粒经测序验证序列正确后，分别转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，氨苄霉素培养基筛选，获得pDEST17-NSs阳性菌落。

1.7 西花蓟马VDAC, TZSV NSs和TSWV NSs融合蛋白的诱导表达

pGEX-4T-1-VDAC和分别来源于TZSV和TSWV的pDEST17-NSs质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，挑取单菌落，分别接种于100 mg/L Amp和50 mg/L Kan的LB液体培养基中培养，0.5 mmol/L IPTG诱导表达融合蛋白。离心收集菌体，重悬于PBS，超声破碎后离心，上清、沉淀及对照样品(pGEX-4T-1空载体，仅表达GST蛋白)进行SDS-PAGE电泳分析。

1.8 GST Pull-down技术验证NSs蛋白与VDAC蛋白的相互作用

向装有谷胱甘肽琼脂糖4B(glutathione sepharose 4B)的纯化柱中加入蛋白结合缓冲液(50 mmol/L Tris-HCl, pH 7.4, 100 mmol/L NaCl)，平衡5个柱体积。加入1.7节原核表达的VDAC-GST大肠杆菌裂解液，以表达GST蛋白的菌裂解液作为对照。放置于4℃水平振荡仪上充分振荡2～4 h后，用预冷的PBS缓冲液冲洗5～8次，弃掉非结合蛋白和杂蛋白。再将1.7节NSs-His大量诱导的菌裂解液(超声破碎，离心过滤后)分别加入结合GST-VDAC蛋白和GST蛋白的谷胱甘肽琼脂糖4B悬浮液中。同时设TSWV的NSs为对照蛋白，同样4℃水平振荡仪上缓慢振荡2～4 h。PBS冲洗5～8次，弃掉非结合蛋白，洗脱缓冲液(50 mmol/L Tris-HCl, pH 7.4, 10 mmol/L NaCl, 10 mmol/L还原性谷胱甘肽)洗脱纯化柱，收集样品，用于SDS-PAGE和Pull-down实验分析。用抗His抗体检测VDAC-GST和NSs-His的互作情况。抗GST抗体检测VDAC-GST和GST表达情况。

2 结果

2.1 酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-NSs

以TZSV侵染植株总RNA反转录后的cDNA为模板，PCR扩增TZSVNSs。如图1所示，获得1 380 bp的特异性片段，与预期TZSVNSs片段大小一致。扩增产物构建至pEASY-T1克隆载体，获得pEASY-NSs，经NdeⅠ/BamHⅠ双酶切验证，得到3 928 bp的载体片段和1 380 bp的TZSVNSs片段，插入片段大小与目的基因大小一致(图2: A)。通过NdeⅠ/BamHⅠ双酶切pEASY-NSs和pGBKT7，将TZSVNSs构建至酵母表达载体pGBKT7上，双酶切鉴定，得到7 300 bp左右的载体片段和1 380 bp的TZSVNSs片段(图2: B)，测序结果分析无误，表明成功构建了酵母表达载体pGBKT7-NSs。

图1 PCR扩增TZSV NSsFig. 1 PCR amplification product of TZSV NSs M: Trans2K Plus Ⅱ DNA marker; 1-4: PCR产物PCR products.

图2 pEASY-NSs克隆质粒(A)和pGBKT7-NSs重组质粒(B)的双酶切鉴定Fig. 2 Double enzyme digestion of the cloning plasmid pEASY-NSs (A) and the recombinant plasmid pGBKT7-NSs (B) M: Trans2K Plus Ⅱ DNA marker; 1: pEASY-NSs克隆质粒的酶切产物Restriction enzyme digestion product of the cloning plasmid pEASY-NSs; 2: pEASY-T1克隆质粒的酶切产物Restriction enzyme digestion product of the cloning plasmid pEASY-T1; 3: pGBKT7质粒的酶切产物Restriction enzyme digestion product of the plasmid pGBKT7; 4, 5: pGBKT7-NSs重组质粒的酶切产物Restriction enzyme digestion product of the recombinant plasmid pGBKT7-NSs.

2.2 TZSV NSs蛋白对酵母AH109细胞毒性和自激活活性

比较转化有诱饵载体pGBKT7-NSs及空载体pGBKT7的酵母AH109细胞，发现两组菌落均为白色或棕色，且大小、数量均匀一致(图3)，表明NSs蛋白表达对酵母AH109细胞无毒性。比较分别转化有pGBKT7-NSs/pGADT7-T，阳性载体pGBKT7-p53/pGADT7-T，以及阴性载体pGBKT7-Lam/pGADT7-T的酵母AH109细胞在SD/-His/-Leu/-Trp/-Ade/X-α-Gal、SD/-His/-Leu/-Trp/-Ade和SD/-Trp/-Leu培养基上的生长情况，发现转化有pGBKT7-NSs/pGADT7-T的酵母AH109细胞仅在SD/-Trp/-Leu培养基上生长(图4: C)，而阳性质粒都能够在上述3种培养基上生长(图4: A-C)，并在SD/-His/-Leu/-Trp/-Ade/X-α-Gal培养基上显现蓝色(图4: A)，表明NSs蛋白在AH109细胞内无自激活活性。以上结果表明可用酵母双杂交筛选与TZSV NSs蛋白互作的西花蓟马蛋白。

图3 pGBKT7-NSs诱饵质粒对AH109酵母细胞的毒性Fig. 3 Toxicity of the bait plasmid pGBKT7-NSs to AH109 yeast cellsA: pGBKT7-NSs在SD/-Trp培养基上的生长情况Colony growth of pGBKT7-NSs on the medium SD/-Trp; B: pGBKT7在SD/-Trp培养基上的生长情况Colony growth of pGBKT7 on the medium SD/-Trp.

图4 pGBKT7-NSs诱饵质粒对AH109酵母细胞的自激活Fig. 4 Autoactivation of the bait plasmid pGBKT7-NSs to AH109 yeast cellsA: SD/-His-Leu-Trp-Ade/X-α-Gal; B: SD/-His-Leu-Trp-Ade; C: SD/-Leu-Trp. +: 阳性对照Positive control pGBKT7-53/pGADT7-T; -: 阴性对照Negative control pGBKT7-Lam/pGADT7-T;A: pGBKT7-NSs/pGADT7-T.

2.3 酵母双杂交筛选与TZSV NSs互作的西花蓟马蛋白

将西花蓟马cDNA文库质粒转化到含有诱饵质粒pGBKT7-NSs的AH109感受态细胞，观察菌落生长及变蓝情况(图5)。挑取菌落生长状况变蓝的菌落，接种至加有氨苄青霉素的SD/-Trp/-Leu液体培养基中扩繁并提取酵母质粒，PCR鉴定cDNA插入片段的大小。将扩增大于500 bp的酵母质粒转化至大肠杆菌细胞，测序并进行BLAST分析。 通过序列比对发现阳性克隆主要为VDAC(约1 000 bp)(GenBank登录号: XM_026416489.1)和缺失突变5′端序列突变体VDAC-M基因(约600 bp)(图6)。

图5 西花蓟马cDNA文库质粒转化含有诱饵质粒 pGBKT7-NSs的AH109酵母细胞的培养物Fig. 5 Culture of the transformation of cDNA library plasmid of Franiklinella ocicdentalis into AH109 yeast cells containing the bait plasmid pGBKT7-NSs

图6 酵母双杂交筛选西花蓟马cDNA文库中阳性克隆质粒的PCR鉴定Fig. 6 PCR identification of positive clones in cDNA library of Franiklinella ocicdentalis obtained by yeast two-hybrid screening VDAC: 类电压依赖性阴离子通道Voltage-dependent anion-selective channel-like. VDAC-M: 缺失突变5′端序列的VDAC突变体The 5′terminal deletion mutant of VDAC. M: Trans2K Plus Ⅱ DNA marker; 1-5, 7, 9-11, 13-15: VDAC-M; 6, 8, 12: VDAC.

2.4 酵母细胞内TZSV NSs与西花蓟马VDAC的相互作用

为了进一步验证TZSV NSs和西花蓟马蛋白VDAC的相互作用，本研究将pGBKT7-NSs和pGADT7-VDAC重新共转化酵母AH109感受态细胞，涂布平板，发现pGBKT7-NSs/pGADT7-VDAC实验组及阳性对照组的酵母生长情况较好(图7: A, C)，其他对照组酵母没有生长迹象(图7: B, D-F)。这表明了西花蓟马VDAC蛋白和TZSV NSs在酵母中存在相互作用。

图7 pGBKT7-NSs和pGADT7-VDAC共转化AH109 酵母细胞的培养物Fig. 7 Culture of the cotransformation of pGBKT7-NSs and pGADT7-VDAC into AH109 yeast cellsA: 阳性对照Positive control (pGBKT7-p53/pGADT7-T); B: 阴性对照Negative control (pGBKT7-Lam/pGADT7-T); C: pGBKT7-NSs/pGADT7-VDAC; D: pGBKT7/pGADT7-VDAC; E: pGBKT7-NSs/pGADT7; F: pGBKT7/pGADT7. VDAC: 类电压依赖性阴离子通道Voltage-dependent anion-selective channel-like.

2.5 GST Pull-down体外验证NSs与西花蓟马VDAC的相互作用

GST Pull-down结果显示，在VDAC-GST和NSs-His共同沉淀组中检测到条带，与预计蛋白大小一致；而阴性对照组未检测到条带(图8)，说明TZSV的NSs-His能够与VDAC-GST在体外结合，而不能与阴性对照GST结合，同时证明VDAC-GST不能够与阴性对照TSWV的NSs-His结合。 由此得出西花蓟马VDAC与TZSV的NSs存在体外特异性相互作用。

图8 GST Pull-down验证TZSV NSs与西花蓟马VDAC的体外互作关系Fig. 8 Interaction in vitro between TZSV NSs and VDAC of Franiklinella ocicdentalis verified by GST Pull-down Pull-down: Pull-down蛋白Pull-down protein; Input: 大肠杆菌总蛋白Total protein from cell extracts of Escherichia coli. +: 互作Interactive; -: 非互作Non-interactive.

3 讨论

本研究成功构建了NSs蛋白的酵母诱饵表达载体pGBKT7-NSs，用酵母双杂交系统从西花蓟马cDNA文库中初步筛选到与NSs互作的介体蛋白类电压依赖性阴离子通道(VDAC)。为了进一步确定NSs和VDAC之间相互作用，本研究通过GST Pull-down技术对TZSV NSs与VDAC的相互作用进行了体外验证。大肠杆菌内IPTG诱导VDAC-GST和对照GST蛋白，并纯化后捕获NSs-His蛋白，洗脱后经SDS-PAGE和Pull-down分析结果表明，TZSV NSs与VDAC蛋白在体外存在相互作用。VDAC是一种具有高度保守性的线粒体外膜孔状蛋白，也是一种具有电压依赖性和阴离子选择性的嵌入蛋白，通常具有β-折叠构成的跨膜结构，由10个氨基酸组成，广泛地存在于真核生物中(Schulz, 2000; Godboleetal., 2003)。VDAC位于线粒体的外膜，是线粒体代谢物进出的屏障，控制线粒体与其他部分的交互作用，在线粒体膜上形成亲水性通道，控制着线粒体内物质的进出，维持线粒体的稳态，VDAC的异常则会引起线粒体功能的紊乱(Bay and Court, 2002)。VDAC的表达水平升高或是降低均可使线粒体功能受到影响，在细胞生存中起着重要作用(Abu-Hamadetal., 2006; Shoshan-Barmatzetal., 2010)。例如，Vander-Heiden等(2000)在心衰动物模型和心衰患者的心脏中均发现了心肌细胞凋亡，同时检测到VDAC表达的下降。Sampson等(2001)研究发现，敲除了VDAC基因的雄性小鼠的精子细胞活力明显下降。VDAC下调导致细胞凋亡的机制尚不清楚，推测可能原因是VDAC的减少抑制线粒体功能，导致线粒体膜通透性发生改变，释放蛋白如细胞色素C、Smac/Diablo、细胞凋亡因子等最终导致凋亡(Green and Kroemer, 2004)。

除了调节线粒体的代谢和能量功能外，VDAC似乎是各种细胞存活和细胞死亡信号的汇聚点，这些信号由其与各种配体和蛋白质的关联介导(戴琼艳和段满林, 2015)。例如，脑神经药物多巴胺可使神经细胞线粒体VDAC的mRNA表达水平及蛋白表达水平降低，ATP水平也降低，诱导凋亡发生(Premkuar and Simantov, 2002)。因此推测，VDAC与TZSV NSs的互作关系成正相关关系，VDAC的下调可能会导致细胞的凋亡。故VDAC与TZSV NSs互作机制有待进一步研究，这不但有助于揭示TZSV NSs的分子作用机制，也能为研究VDAC的生物学功能奠定基础。