松毛虫赤眼蜂一氧化氮合酶基因的克隆、原核表达及在不同滞育阶段的表达谱分析

姜雪冰, 张 雪, 杜文梅, 邹 振, 张俊杰,*

(1. 吉林农业大学生物防治研究所, 生物防治技术工程研究中心, 长春 130118; 2. 中国科学院动物研究所, 农业虫害鼠害综合治理研究国家重点实验室, 北京 100101)

松毛虫赤眼蜂Trichogrammadendrolimi隶属于膜翅目(Hymenoptera)赤眼蜂科(Trichogrammatidae)赤眼蜂属Trichogramma，能寄生多种农林害虫的卵，如亚洲玉米螟Ostriniafurnacalis、水稻二化螟Chilosuppressalis等(李丽英, 1984; 林乃铨, 1987)。在松毛虫赤眼蜂工厂化生产的过程中，天敌昆虫的保存是一个十分重要的环节(张俊杰等, 2015)。传统的方法是利用低温对松毛虫赤眼蜂商品进行保存，但低温保存的劣势也是比较明显的，经过低温冷藏的松毛虫赤眼蜂在寄生率、羽化率等指标上均显著下降，直接地影响了松毛虫赤眼蜂的防治效果(张俊杰等, 2018)。滞育技术的应用能很好地解决松毛虫赤眼蜂商品的保存问题。尽管滞育技术已经在松毛虫赤眼蜂工厂化生产中得以应用(Zhangetal., 2018)，但对于松毛虫赤眼蜂滞育诱导及解除的机制还不甚了解，这也使得滞育技术的运用存在着极大的局限性。因此，为了进一步促进松毛虫赤眼蜂的工厂化生产进程，提高生物防治的效果，亟需对影响滞育的分子机制进行深入的探究。

一氧化氮(nitric oxide, NO)作为一种具有自由基特性的活性分子，参与多种昆虫的生命活动，如激活昆虫的先天性免疫(Ishiietal., 2013; Sadekuzzamanetal., 2018)，激活精子(Nagaokaetal., 2017)，并可以作为神经系统的信号分子(Müller, 1997)。还有报道证实，NO对蜜蜂Apis的嗅觉记忆及嗅觉驯化均有重要作用(Müller and Hildebrandt, 2002)。在其他动物如卤虫中，NO还可以作为活性氮物质促进个体囊胚发育(Villalobo, 2006; Formanetal., 2008; 杜滨, 2012)。在近年来的研究中还发现，NO与水稻二化螟的滞育有着密切的联系(Luetal., 2013)。

生物体内催化一氧化氮合成的酶即为一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, NOS) (Rivero, 2006; Poytonetal., 2009)。一氧化氮合酶通过两步反应催化生成一氧化氮：(1)由L-精氨酸生成NG-羟基-L-精氨酸(L-NHA)；(2) L-NHA转变为L-瓜氨酸及一氧化氮(Zhu and Silverman, 2008)。Kitta等(2016)在研究家蚕Bombyxmori的NOS的过程中发现，BmNOS在家蚕胚胎发育的早期有着重要的作用，这一研究也证明了NOS对家蚕的滞育发育具有一定的影响。而相关研究在天敌昆虫松毛虫赤眼蜂中的研究尚未见报道，因此，本研究克隆了松毛虫赤眼蜂NOS基因的cDNA，并对其序列进行分析、原核纯化及滞育相关表达分析，为进一步阐明该基因在调控松毛虫赤眼蜂滞育和发育过程中的作用奠定了基础，为松毛虫赤眼蜂的工厂化生产中，滞育技术的灵活应用提供了重要的基础资料。

1 材料与方法

1.1 试虫来源

本实验所用松毛虫赤眼蜂采自于黑龙江省尚志市苇河镇玉米田，寄生于亚洲玉米螟卵内，在26±1℃，RH 60%±5%，光周期14L∶10D的培养箱中，培养至成蜂后，按赤眼蜂∶柞蚕卵=8∶1的比例提供新鲜柞蚕卵继续繁育，繁育至少5代的赤眼蜂才被用于后续实验(张俊杰等, 2019)。目前松毛虫赤眼蜂一直在吉林农业大学生物防治研究所用柞蚕卵繁育。实验中所用到的柞蚕卵为在25±1℃温度条件下，柞蚕茧发育至出蛾后剖腹取得，并用0.1%新洁尔灭浸泡消毒10 min，晾干备用。其中柞蚕茧采购自吉林省永吉县(张俊杰, 2015)。

1.2 滞育及滞育解除模型的构建

滞育诱导：在26±1℃，RH 60%±5%，光周期14L∶10D的培养箱中，以1.1节柞蚕卵繁育的松毛虫赤眼蜂发育至幼虫中期后，置于12℃，RH 60%±5%，全暗条件下30 d。30 d后解剖寄主卵观察，仍停留在预蛹期的松毛虫赤眼蜂个体即判定其进入滞育状态。

滞育解除：将滞育松毛虫赤眼蜂置于3℃，RH 60%±5%，全暗条件下70 d，转入正常发育条件(同1.1节)下培养，可继续发育至蛹期的个体即为成功解除滞育的个体(张俊杰, 2015)。

本实验中共设置5组样品，分别为：滞育预蛹(diapause prepupa, Dpre)，正在诱导解除滞育预蛹(prepupa after diapause termination, DT)，滞育解除后的蛹(pupa after diapause, Dp)，正常发育的预蛹(non-diapause prepupa, NDpre) 和正常发育的蛹(non-diapause pupa, NDp)。其中，NDpre及NDp作为对照组。

1.3 总RNA提取及cDNA合成

分别取来自一粒柞蚕卵内的Dpre, DT, Dp, NDpre和NDp个体以TRIzol溶液(Sigma Aldrich, St. Louis, MO)进行总RNA提取(一粒柞蚕卵中的松毛虫赤眼蜂个体数约90头)，提取的RNA样品经1%琼脂糖凝胶电泳及NanoDrop (Thermo Scientific, 美国)进行质量检测后，进行反转录(TaKaRa, 日本)，合成的cDNA作为后续实验的模板。

1.4 内参基因的筛选和不同滞育阶段松毛虫赤眼蜂TdNOS基因表达谱分析

结合已发表的文章选定GAPDH,β-Actin, 18S rRNA和25S rRNA 4个较为常见的内参基因(魏永赞等, 2012)，用qPCR技术检测4个待定的内参基因在松毛虫赤眼蜂的5种不同滞育阶段(Dpre, DT, Dp, NDpre和NDp)的表达量。PCR反应体系10 μL如SYBR®Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)试剂盒(TaKaRa,日本)说明书所示。反应程序： 95℃预变性30 s； 95℃变性5 s, 60℃退火30 s, 40个循环。溶解曲线：起始温度60℃，终温度95℃，持续1 s，温度增量0.2℃； 20℃ 10 s。利用BestKeeper程序进行定量结果的分析(吴建阳等, 2017)，以筛选最为稳定的内参基因。

基于前期转录组测序技术(RNA-Seq)获得不同滞育阶段松毛虫赤眼蜂转录组数据(project number PRJNA597631)，筛选出NOS基因TdNOS。以1.3节获得的cDNA为模板，采用qPCR对5种不同滞育阶段松毛虫赤眼蜂Dpre, DT, Dp, NDpre和NDp样本中NOS基因的表达量进行定量分析；每组样本重复4次。PCR反应体系10 μL，体系中各成分具体组成及反应程序如SYBR® Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)试剂盒(TaKaRa, 日本)说明书所示。实验中所使用的引物均由Primer Premier 6 (Premier, 加拿大)软件设计(表1)。以2-ΔΔCt法计算目标基因及内参基因的相对表达量(Livak and Schmittgen, 2001)。

表1 实验所用引物Table 1 Primers used in the experiment

1.5 TdNOS基因cDNA序列克隆

根据1.4节qPCR结果，以TdNOS表达量最高的样本cDNA为模板对TdNOS的cDNA序列进行克隆。PCR反应体系(50 μL)和具体反应程序参考Easy-Taq DNA聚合酶说明书(TaKaRa, 日本)。PCR产物连接至pGEM-T载体并转化到大肠杆菌EscherichiacoliDH5α感受态细胞中，筛选阳性克隆，送生工生物工程股份有限公司(上海)测序，拼接后获得TdNOS的cDNA序列。并在同样条件下，以取未被寄生的新鲜柞蚕雌蛾剖腹取卵，0.1%新洁尔灭浸泡消毒10 min，晾干，解剖后用200 μL移液枪将卵液移至1.5 mL EP管中，按1.3节中的方法提取柞蚕卵总RNA，反转录得到cDNA样品，以该样品为模板进行NOS基因cDNA序列的克隆，作为对照。

1.6 TdNOS cDNA序列分析

核苷酸序列比对使用blast工具(https:∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn &PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome)；预测蛋白保守结构域的网站为： https:∥ www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi；用DNAMAN软件推导编码氨基酸序列；用NetPhos 3.1 Server程序分析磷酸化修饰位点；氨基酸序列比对使用ClustalX2.0软件；蛋白二级结构预测使用在线软件PRABI(https:∥npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_a utomat.pl? page=nps a_sopm.html)；蛋白三级结构预测使用在线软件https:∥swissmodel.expasy.org/interactive；蛋白亲水性使Protscale(https:∥web.expasy.org/protscale/)分析；使用TMHMM Server v. 2.0(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)分析蛋白的跨膜结构；使用SignalP-5.0 Server分析信号肽；使用MEGA7.0软件最大简约法(maximum parsimony, MP)(bootstrap=1 000)建立系统进化树并分析。

1.7 TdNOS原核表达及及特异性抗体的制备

构建重组载体TdNOS/pET-28a，转化至大肠杆菌E.coliDH5α感受态细胞中，在含有卡那霉素(50 μg/mL)的LB平板中过夜培养，挑取阳性克隆的单菌落进行培养并提取质粒，并测序验证。将验证后的重组质粒转入大肠杆菌BL21中，挑取阳性克隆过夜培养，并在新的LB培养基中以37℃ 200 r/min的条件培养至OD600=0.6，然后加入2.5 μL的IPTG培养16 h。收集菌体超声破碎后进行SDS-PAGE蛋白电泳分析，以未加入IPTG诱导的菌液为对照。观察到目的条带后，改用900 mL LB液体培养基(含50 μg/mL Kan+)大量诱导菌体表达，收集菌体超声破碎，使用Ni-NTA琼脂糖亲和进行层析纯化，在蛋白纯化的过程中，利用不同浓度(100, 150和200 mmol/L)的咪唑溶液对蛋白进行洗脱，收集纯化后的蛋白送样至华大基因有限公司进行多克隆抗体的制备(兔抗)。

取4组松毛虫赤眼蜂(Dpre, Dp, NDpre和NDp)样本及10粒未被寄生的新鲜柞蚕卵的卵液样本，每组赤眼蜂样品为10粒柞蚕卵内包含的全部松毛虫赤眼蜂(每粒卵内约含松毛虫赤眼蜂90头)。分别置于1.5 mL EP管中，加300 mL RIPA裂解液(含胰蛋白酶抑制剂)，用破碎仪进行破碎处理。 冰上孵育30 min，细胞充分裂解后，4℃ 14 000 g离心10 min，将上清液转至新的EP管中，进行Western blot检测。

1.8 TdNOS蛋白质谱检测

收集1.7节中表达纯化的TdNOS进行SDS-PAGE蛋白电泳，并对目的条带进行切割、纯化，加入100%乙腈(ACN)进行脱水，再加入10 mmol/L二硫苏糖醇(DTT)还原二硫键，同时，为抑制蛋白降解并封闭巯基，加入55 mmol/L碘乙酰胺，去除后以碳酸氢铵溶液清洗、孵育，经超声清洗，加入胰蛋白酶过夜孵育。过夜孵育后取上清，加入600 μL，6% ACN/0.1% TFA(乙腈/三氟乙酸)，真空悬干得到5～10 μL样品，加入60 μL 2% ACN/0.1% TFA(乙腈/三氟乙酸)，再经超声处理及高速离心(4℃ 14 000 g, 10 min)后收集到的上清液用于质谱检测，并对蛋白质质谱结果进行分析。

1.9 数据分析

各处理之间的差异用单因素方差分析(one-way ANOVA)和Duncan氏多重比较(P<0.05)方法比较平均值的差异显著性。利用SPSS Statistic 19.0软件(IBM, 美国)及GraphPad Prism7 (GraphPad, 美国)软件对数据进行整理、统计。以2-ΔΔCt法计算目标基因及内参基因的相对表达量(Livak and Schmittgen, 2001)。

2 结果

2.1 不同滞育阶段松毛虫赤眼蜂TdNOS的表达量

利用BestKeeper程序计算GAPDH,β-Actin, 18S rRNA和25S rRNA 4个内参基因之间的相关系数和程序指数，结果表明GAPDH和25S rRNA基因的标准差和协方差值明显低于其他两个基因，且GAPDH的相关系数高达0.90(表2)，因此选取GAPDH作为分析TdNOS表达量的内参基因。

表2 BestKeeper计算出的内参基因稳定性参数Table 2 Stability of selected reference genes calculated by BestKeeper

qPCR结果可知，TdNOS转录本在松毛虫赤眼蜂的不同滞育阶段均有表达，但是表达量存在显著差异(P<0.05)。其中，在解除滞育后蛹期个体(Dp)中，TdNOS的表达量远高于其他几个发育阶段个体(Dpre, DT, NDpre和NDp)中的；处于预蛹期的松毛虫赤眼蜂个体(Dpre和NDpre)，无论是否滞育，其TdNOS的表达量均较低；但是在经过30 d低温处理正在诱导解除滞育预蛹期个体(DT)中，TdNOS的表达量明显提升，在滞育发育过程(Dpre-DT-Dp)中，TdNOS的表达量呈明显的上调趋势(图1)。

图1 TdNOS在不同滞育阶段松毛虫赤眼蜂中 的相对表达量Fig. 1 Relative expression levels of TdNOS in Trichogramma dendrolimi at different diapause stages Dpre: 滞育预蛹Diapause prepupa; DT: 正在诱导解除滞育的预蛹Prepupa after diapaue termination; Dp: 滞育解除后的蛹Pupa after diapause; NDpre: 正常发育的预蛹Non-diapause prepupa; NDp: 正常发育的蛹Non-diapause pupa. 图中数据为平均值±标椎误，不同阶段样本中基因表达量以滞育的预蛹中的表达量为基准。柱上不同小写字母表示不同阶段样本中基因表达量差异显著(P<0.05, Duncan氏多重比较)。Data in theFigure are mean±SE. The relative expression levels of the gene in samples of different stages are normalized to that in the diapause prepupa. Different lowercase letters above bars indicate significant differences in the gene expression level in samples among different stages (P<0.05, Duncan’s multiple comparisons).

2.2 TdNOS序列特征

克隆获得的目的片段大小为1 014 bp，而以柞蚕卵为模板进行PCR扩增并未有目的条带产生(图2)，通过blast对比鉴定为一氧化氮合酶基因，登记为TdNOS(GenBank登录号: MN650600)。通过生物信息学对该序列编码的氨基酸序列进行分析和预测，结果表明，该序列共编码337个氨基酸(图3)，无信号肽及跨膜结构，含丝氨酸磷酸化位点33个，酪氨酸磷酸化位点7个，苏氨酸磷酸化位点10个，为亲水性蛋白。其二级结构主要由α螺旋及无规则卷曲构成，其次由延伸链和β转角组成。

图2 NOS基因cDNA序列PCR扩增结果Fig. 2 PCR amplification results of cDNA sequence of NOS geneA: 松毛虫赤眼蜂体内NOS基因的PCR扩增结果The PCR amplification results of NOS gene in Trichogramma dendrolimi; B: 未被寄生的柞蚕卵内NOS基因的PCR扩增结果The PCR amplification results of NOS gene in unparasitized eggs of Antheraea pernyi.

图3 松毛虫赤眼蜂TdNOS的核苷酸及编码的氨基酸序列Fig. 3 Nucleotide and amino acid sequences of TdNOS of Trichogramma dendrolimi 加方框的核苷酸序列表示起始密码子和终止密码子，加方框的氨基酸表示保守的半胱氨酸。The nucleotide sequences in box represent the start codon and the stop codon, and the amino acids in box represent conserved cysteines.

2.3 NOS系统发育树

通过构建系统发育树(图4)可知，在选择的21种昆虫中，松毛虫赤眼蜂与短管赤眼蜂Trichogrammapretiosum的NOS序列一致性最高(98.95%)，其次与膜翅目中的其他5种昆虫聚为一支，符合分类学上的分类关系;选择的其他昆虫种类，半翅目的两种昆虫聚在一起，双翅目、鞘翅目及鳞翅目的昆虫也分别聚成一支，但就NOS序列而言，它们与膜翅目之间的关系尚待进一步考量。

图4 最大简约法构建的基于氨基酸序列的NOS系统发育树Fig. 4 Phylogenetic tree of NOS based on amino acid sequences by maximum parsimony method

2.4 TdNOS原核表达及蛋白表达谱

本研究克隆了TdNOS的ORF序列，且构建重组表达载体TdNOS/pET-28a。通过SDS-PAGE电泳检测，确定TdNOS蛋白主要存在于包涵体内。在蛋白纯化的过程中，利用200 mmol/L咪唑溶液时，目的蛋白的洗脱效果最佳(图5: A)。获得TdNOS特异性抗体(兔抗)，并检测在不同滞育阶段松毛虫赤眼蜂中TdNOS蛋白的表达量(图5: B)，Western blot测结果与qPCR检测结果一致，在解除滞育的蛹(Dp)中TdNOS在转录及翻译水平的表达量均是最高的，而在未被寄生的柞蚕卵总蛋白中则无目的蛋白条带。

图5 重组蛋白TdNOS的诱导表达(A)及Western blot分析TdNOS在不同滞育阶段松毛虫赤眼蜂中的表达量(B)Fig. 5 Induced expression of the recombinant protein TdNOS (A) and the expression levels of TdNOS in Trichogramma dendrolimi at different diapause stages detected by Western blot (B) M: 蛋白标准分子量Protein molecular weight marker; 1, 2, 3: 用200 mmol/L咪唑洗脱纯化的重组蛋白TdNOS Purified recombinant protein TdNOS eluted by 200 mmol/L imidazole. Dpre: 滞育预蛹Diapause prepupa; Dp: 滞育解除后的蛹Pupa after diapause; NDp: 正常发育的蛹Non-diapause pupa; NDpre: 正常发育的预蛹Non-diapause prepupa; AP-1, AP-2: 未被寄生柞蚕卵总蛋白的两次生物学重复Two biological replicates of the total protein of unparasitized Antheraea pernyi egg.

2.5 TdNOS蛋白质谱检测结果

质谱鉴定结果表明本研究中纯化的目的蛋白为一氧化氮合酶(NOS)，具体指标如表3所示。

表3 质谱鉴定TdNOS蛋白条带结果Table 3 Identification of TdNOS protein by mass spectrometry

3 讨论与结论

滞育是昆虫中极为常见的一种现象，是昆虫在长期的进化过程中形成的，用于应对不良环境条件的一种生存策略(Handetal., 2016)。进入滞育的昆虫都表现出相似的特性，如新陈代谢速度减慢，寿命延长，对外界的抗逆性增强等(Macrae, 2005; Robbinsetal., 2010)。而且区别于休眠(dormancy)，滞育昆虫即使在外界环境恢复到适宜昆虫生长发育时，也不会马上解除滞育。例如：打破家蚕滞育需将其滞育卵放置5℃下低温诱导2个月(Yaginumaetal., 1990)。对于夏滞育的双色泉蝇Pegomyiabicolor而言，10℃处理45 d的时间仅有一半的滞育个体能解除滞育(李爱青和薛芳森, 2002)。松毛虫赤眼蜂作为应用最为成功的天敌昆虫之一，滞育技术的成功应用更是成为更优的天敌昆虫的贮藏方法，其解除滞育的条件为：3℃低温下冷藏至少70 d (张俊杰等, 2018)。通过以上研究可知，昆虫解除滞育的过程是一项十分耗时的过程。目前，滞育技术已经成功应用于天敌昆虫工厂化生产中，而且解除滞育这一过程虽然可以进一步延长昆虫的货架期，但是也为滞育技术的实际应用造成了诸多的不便。因此，对于松毛虫赤眼蜂滞育分子机制的研究，将为松毛虫赤眼蜂的工厂化生产提供重要的基础资料。

在本研究中，NOS的表达量在经历过滞育发育的松毛虫赤眼蜂中显著升高(图1)，这一结果与在家蚕中的研究结果一致。通过HCl处理人为解除家蚕卵滞育，并检测处理后的家蚕卵中NOS的表达量变化情况，结果发现解除滞育后家蚕卵中NOS的表达量显著上调(Kittaetal., 2016)。在果蝇中的研究表明，在果蝇的不同发育阶段，NOS起到的作用是截然相反的，在幼虫发育阶段，NOS起到抑制幼虫生长发育的作用，在幼虫后的发育阶段则会促进果蝇个体的发育(Jaszczaketal., 2015)。但是在本研究中，无论松毛虫赤眼蜂是否经历滞育发育过程，蛹期个体(Dp/NDp)中的NOS的表达量始终高于预蛹期(Dpre/NDpre)(图1)。基于这一结果，作者推测NOS可能促进松毛虫赤眼蜂预蛹期后的个体发育，且经过低温处理的松毛虫赤眼蜂体内会进一步促进NOS的表达，这与经历过滞育的松毛虫赤眼蜂具有更高的产卵能力及更优的种群延续性(Zhangetal., 2018)相吻合。两者之间是否存在关联性也是本研究组后续将要关注内容。

除此之外，通过长时间的滞育发育过程，松毛虫赤眼蜂是否可以顺利解除滞育进入下一阶段的生长发育，一直是工厂化生产滞育松毛虫赤眼蜂过程中重点关注的问题之一。在本研究中，解除滞育后的松毛虫赤眼蜂个体(DT和Dp)中，NOS的基因及蛋白的表达量均有明显的提升(图1; 图5: B)，这一结果说明，在松毛虫赤眼蜂中，NOS不仅在转录水平起到调控的作用，在转录后水平上也起到一定的调控作用。在哺乳动物中，NOS与mTOR通路紧密联系，共同对有机体进行调控，在个体生长发育及疾病(尤其是癌症)的调控中有着重要的作用(Lopez-Riveraetal., 2014; Saeedietal., 2017)，但是其在昆虫中的研究还尚未见报道。因此，本研究的数据可以为研究mTOR/NOS信号通路在昆虫中的作用提供一定的基础及思路。

综上所述，本研究通过克隆松毛虫赤眼蜂NOS基因cDNA序列，对不同发育阶段的NOS基因的表达量进行分析，并成功制备了松毛虫赤眼蜂特异性NOS抗体，为后续深入研究NOS在赤眼蜂及其他昆虫滞育中的作用提供了基础性数据。