对桃蚜高毒力的蜡蚧菌菌株筛选

刘明科, 闫芳芳, 齐禹哲, 黄 岩, 闫雪梨, 钱逸彬, 李茂业,*

(1. 安徽农业大学植物保护学院, 植物病虫害生物学与绿色防控安徽普通高校重点实验室, 合肥 230036; 2. 四川省烟草公司攀枝花市公司, 四川攀枝花 617026)

桃蚜Myzuspersicae又名烟蚜，属半翅目(Hemiptera)蚜科(Aphididae)，是世界上分布最广泛的蚜虫之一，已经发现可以取食800多种植物(van Emden and Harrington, 2017)。其主要为害是通过刺吸植株汁液导致叶片卷曲萎蔫，分泌蜜露诱发煤污病以及传播各种植物病毒造成植株矮缩，叶片花叶、畸形(Novyetal., 2002; Loweryetal., 2015)。目前对蚜虫的防治主要以化学防治为主，但是随着蚜虫对常用杀虫剂的抗药性不断增强(Feng and Isman, 1995; Fosteretal., 2000; Srigirirajuetal., 2009; Bassetal., 2011, 2014; Lietal., 2016)，导致该虫的防治越来越困难，同时农民对杀虫剂的用量也不断加重，致使人们对保障生态安全和食品安全更加担忧。近年来，随着人们对生态环保的观念不断加深，对绿色、有机食品的强烈需求，开发利用环境友好型农药来防治蚜虫越来越受到人们的重视。

为了克服大量使用化学杀虫剂所引起的一系列问题，许多学者已对昆虫病原真菌防治害虫进行了广泛的研究，如球孢白僵菌Beauveriabassiana、布氏白僵菌B.brongniartii、金龟子绿僵菌Metarhiziumanisopliae、玫烟色棒束孢Paecilomycesfurmosoroseus等具有广泛杀虫作用的虫生真菌已经商品化，并且应用于农林害虫防治中(Vandenbergetal., 2001; Hattingetal., 2004; Hajeketal., 2006; de Faria and Wraight, 2007; Lietal., 2010; Shresthaetal., 2015)。蜡蚧菌Lecanicillium也是一类重要的广谱性昆虫病原真菌(蒲蛰龙和李增智, 1996)，其中，蜡蚧轮枝菌Lecanicilliumlecanii和渐狭蜡蚧菌L.attenuatum已报道对蚜虫具有致病性(Vuetal., 2007; Kimetal., 2008)，但尚未见刀孢蜡蚧菌L.psalliotae对蚜虫的致病性研究。

本研究选择安徽农业大学植物保护学院昆虫病理实验室已分离纯化并鉴定的3个刀孢蜡蚧菌菌株和4个渐狭蜡蚧菌菌株共7个菌株，测定各菌株与毒力相关的生物学性状，同时以桃蚜作为供试昆虫，通过室内毒力测定比较各菌株间的致病性，并将累计校正死亡率大于60%的菌株进行时间-剂量-死亡率关系分析，获得对桃蚜无翅成蚜高毒力的蜡蚧菌菌株，并用体式显微镜观察其对桃蚜的侵染过程，以期为蚜虫的生物防治提供新的生防材料和进一步商品化提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

供试菌株保藏于安徽省微生物重点实验室。试验前，用接种针挑取一定量孢子接种到SDAY培养基上，在26℃孢子霉菌培养箱中黑暗培养15 d作为供试菌株。各菌株寄主、原始采集地及采集时间见表1。

表1 供试蜡蚧菌菌株的采集信息Table 1 Collecting data of the tested Lecanicillium strains

1.2 供试昆虫

供试桃蚜于2017年采自四川省泸州市烟草试验基地，在安徽农业大学植物保护学院昆虫生态饲养室内用烟草(云烟87)人工饲养多代，饲养条件为25±1℃，光周期16L∶8D。挑选大小一致，活力较强的无翅成蚜于长势良好的干净烟草叶片上，12 h后将成蚜挑离叶片，剩下若蚜在叶片上继续饲养至成蚜，挑选最后一次蜕皮1～2 d内活力强的无翅成蚜作为试虫。

1.3 菌落生长及产孢量性状观测

将活化后的菌株在直径为9 cm的SDAY培养基平板上分别用菌液点植培养法接种，蘸取供试菌株浓度为1.0×106/mL的分生孢子悬浮液点植在平板中心，呈一个圆形接种面，每菌株接4个培养皿。接菌后分别置于(25±1)℃、RH>85%和光周期12L∶12D光照培养箱培养。每日观测记录菌落形态、颜色、及分生孢子层色泽。从第3天开始，每日测量1次菌落纵横2个方向的直径，取其平均值，15 d后用边长为1 cm的正方形打孔器分别在菌落中心和菌落边缘和两条直径测量线交叉处取菌块5个，放入10 mL含有0.05% Tween-80无菌水的试管中，在涡旋混合器上振荡10 min，用血球计数板测定孢子含量。用无菌水将菌株分生孢子配成1.0×106孢子/mL的悬浮液，用移液枪吸取15 μL滴在含SDAY固体培养基的载玻片上，将载玻片置于25±1℃的无菌环境下培养，在18 h用显微镜随机镜检5个不同视野，记录孢子萌发率。

1.4 菌株对桃蚜无翅成蚜的致病力测定

将活化后的7个菌株的分生孢子分别刮到盛有无菌水的试管中，在涡旋混合器上充分振荡10 min，用2层无菌棉布过滤掉多余菌丝，并用血球计数板在显微镜下计数后配制成浓度为2.0×107孢子/mL的孢子悬浮液备用。

采用浸渍法接种，将带有蚜虫的烟叶用镊子夹住叶柄在菌液中浸渍2 s，取出后去除多余菌液，将接种的成蚜用软毛刷转移到150 mm玻璃培养皿中的新鲜烟叶上，叶柄用吸水性较好的灭菌脱脂棉球包住并加入无菌水，再用保鲜膜包住脱脂棉球，每个培养皿中放一片烟叶，每片烟叶接20头蚜虫作为一个处理，每个处理4次重复，对照组用无菌水处理蚜虫。将处理后盛放蚜虫的培养皿放入温度为25±1℃，相对湿度85%±3%，光周期为16L∶8D人工气候箱中，连续7 d观察记录桃蚜死虫数并及时挑出若虫和死虫，计算死亡率。

1.5 菌株对桃蚜无翅成蚜的毒力测定

取致病力测定中筛选出来对桃蚜死亡率大于60%的菌株分生孢子，依次按照梯度稀释，配制成5个浓度(1.0×104, 1.0×105, 1.0×106, 1.0×107和1.0×108孢子/mL)的孢子悬浮液，分别接种无翅成蚜，以无菌水处理作为对照，每个处理30头，重复4次。处理、饲养和观察方法如同1.4节。

1.6 菌株对桃蚜无翅成蚜的侵染过程观察

将筛选出的高毒力菌株以1.0×108孢子/mL的孢子悬浮液用浸渍法(同1.4节)感染桃蚜无翅成蚜，每隔24 h用体式显微镜观察并记录桃蚜的体表变化。

1.7 数据分析

用WPS软件对数据做初步整理并计算各处理的死亡率，以Abbott公式计算校正死亡率(公式如下)。用DPS7.05软件(唐启义和冯明光, 2002)对试验数据进行统计分析，计算致死中时(LT50)和致死中浓度(LC50)，采用Duncan氏新复极差法进行多重比较。

校正死亡率(%)=

2 结果

2.1 蜡蚧菌菌株的菌落形态和培养性状

供试蜡蚧菌菌株在SDAY培养基上的菌落形态均为毛毡状，菌落色泽和孢子粉色泽为白色或乳白色(图1)。由表2可以看出，供试蜡蚧菌菌株在SDAY培养基上的菌落直径(5 d:F6,21=29.21,P<0.0001; 10 d:F6,21=47.71,P<0.0001; 15 d:F6,21=50.63,P<0.0001)、产孢量(F6,28=57.48,P<0.0001)和萌发率(F6,28=2.02,P<0.1)存在显著性差异。其中 HFLP006 和 HFLA032 菌株的菌落生长最快，15 d的菌落直径分别为50.75 mm和51.13 mm，二者无显著性差异(P>0.05)。15 d后HFLP006菌株的产孢量最高，为13.90×107孢子/cm2，显著高于其他菌株(P<0.05)。 各菌株18 h的孢子萌发率均达到96%以上，其中HFLP006菌株的孢子萌发率为99.28%。

图1 供试蜡蚧菌菌株在SDAY培养基上的菌落形态Fig. 1 Colony morphology of the tested Lecanicillium strains on SDAY mediumA: HFLP006; B: HFLP021; C: HFLP025; D: HFLA032; E: HFLA041; F: HFLA064; G: HFLA066.

表2 供试蜡蚧菌菌株在SDAY培养基上的培养性状Table 2 Culture traits of the tested Lecanicillium strains on SDAY medium

2.2 不同蜡蚧菌菌株对桃蚜无翅成蚜的毒力

由表3可以看出，7个蜡蚧菌均对桃蚜无翅成蚜具有一定的致病性，不同蜡蚧菌对桃蚜无翅成蚜的7 d累计校正死亡率存在显著性差异(F6,21=40.58,P<0.0001)，其中HFLP006菌株引起的无翅成蚜累计校正死亡率最高，为83.56%，致死速率最快，LT50为3.74 d，其次为HFLA032菌株，引起的无翅成蚜累计校正死亡率为63.01%，LT50为5.75 d。其他菌株引起的无翅成蚜累计校正死亡率均未超过50%，LT50均大于7 d。表明这两个菌株对桃蚜无翅成蚜具有较高毒力。

表3 不同蜡蚧菌菌株在2.0×107孢子/mL浓度下对桃蚜无翅成蚜的致病性Table 3 Pathogenicity of Lecanicillium stains at the concentration of 2.0×107 conidia/mL against the apterous adults of Myzus persicae

2.3 菌株对桃蚜无翅成蚜的毒力及侵染过程

桃蚜无翅成蚜的死亡率与速度与HFLP006和HFLA032菌株的处理剂量呈正相关性，但前者对桃蚜无翅成蚜的致病效果更显著。在高浓度1.0×108孢子/mL下，HFLP006菌株引起的桃蚜无翅成蚜累计死亡率达到94.17%，而HFLA032菌株引起的无翅成蚜累计死亡率处于较低水平，为79.17%(图2)。在接种后7 d，HFLP006菌株对桃蚜无翅成蚜的LC50最小，为0.21×106孢子/mL; HFLA032菌株对无翅成蚜的LC50为1.86×106孢子/mL(表4)。

表4 蜡蚧菌菌株HFLP006和HFLA032对桃蚜无翅成蚜的毒力Table 4 Virulence of Lecanicillium strains HFLP006 and HFLA032 against the apterous adults of Myzus persicae

图2 不同浓度菌株HFLP006(A)和HFLA032(B)引起的桃蚜无翅成蚜的逐日累计死亡率Fig. 2 Daily accumulative mortalities of apterous adults of Myzus persicae caused by the stains HFLP006 (A) and HFLA032 (B) at different concentrations CK: 无菌水Sterile water.

从HFLP006菌株对桃蚜无翅成蚜的侵染过程来看，以浓度为1.0×108孢子/mL的孢子悬浮液接种桃蚜2 d后，桃蚜开始行动迟缓、足和头部出现白色丝状菌丝，胸部逐渐变褐，腹部出现褐色斑点，并开始死亡，3 d后全身变为黑褐色，干瘪缩小，足和触角变白，足基部及头部布满菌丝，之后菌丝逐渐布满全身(图3)。

3 讨论

菌株的菌落直径、产孢量和孢子萌发率等生物学性状与对靶标昆虫的毒力具有一定的相关性。李茂业等(2012)从8株绿僵菌菌株中筛选出一株黄绿绿僵菌MetarhiziumflavovirideMf96在室内对Q型烟粉虱Bemisiatabaci2龄若虫的毒力最高，同时其还具有产孢量大、萌发率高和生长快等生物学特性。Zhang等(2011)在白僵菌菌株防治松毛虫的研究中，分离出一株高毒力菌株Bb1801，同时其菌丝生长速度、产孢量、孢子萌发速率，紫外线耐受性均比其他菌株表现优异。本研究通过测定供试菌株菌落直径、产孢量和孢子萌发率，结果表明，HFLP006菌株的菌落生长最快，产孢量和萌发率表现最好，尤其是产孢量显著高于其他菌株(图1; 表2)，这与上述学者的观点基本一致。在进一步开发的过程中，不仅要考虑菌株的高毒力，而且要考虑菌株产孢量和萌发率，因为高产孢量和萌发率的昆虫病原真菌在规模化生产方面一定程度上保证了孢子产量和质量，同时也在一定程度上增加菌株在田间流行性传播的能力，因此更具有田间应用和商品化的潜力。

蜡蚧菌为一个复合种，Zare和Gams(2001)将蜡蚧轮枝菌归纳于一个新属Lecanicillium中，并分出不同的种，且一些种已报道对蚜虫具有一定的致病性，Kim等(2008)分离出的一株渐狭蜡蚧菌L.attenuatum对蚜虫的室内死亡率约为80%，在雨季期间对温室胡椒植物蚜虫死亡率为72%～97%。Vu等(2007)用多种昆虫病原真菌对蚜虫做毒力测定，其中蜡蚧轮枝菌L.lecanii对桃蚜和棉蚜均表现出很高的致病性，其在处理后约5 d和2 d死亡率均接近100%。刀孢蜡蚧菌L.psalliotae虽未见其对蚜虫的致病性报道，但是对于防治南方根结线虫具有一定的效果，Nguyen等(2014)研究表明，刀孢蜡蚧菌对于黄瓜田间的南方根结线虫具有较好的防治效果，且对卵有很强的侵染能力；同样刀孢蜡蚧菌还可以对豆蔻蓟马Sciothripscardamomi具有一定的致病性，Kumar等(2015)在实验室中用1.0×107孢子/mL的刀孢蜡蚧菌孢子悬浮液接种豆蔻蓟马10 d后测试群体中的死亡率可达62.9%；不仅如此，Lu等(2015)研究证明刀孢蜡蚧菌对亚洲柑橘木虱Diaphorinacitri具有较好的侵染能力，在相对湿度为90%，孢子浓度为1.0×108孢子/mL条件下，9 d后引起的死亡率高达92.55%。本试验通过浸渍法，在相对湿度为85%，孢子浓度为2.0×107孢子/mL条件下从7株不同蜡蚧菌菌株中筛选获得对桃蚜无翅成蚜具有高毒力的HFLP006菌株，7 d引起的累计校正死亡率为83.56%，LT50为3.74 d(表3)，LC50为2.06×105孢子/mL(表4)，表明菌株HFLP006对桃蚜的毒力更高。同时本研究用HFLP006菌株以1.0×108孢子/mL浓度感染桃蚜无翅成蚜，2 d后桃蚜行动迟缓，足部长出菌丝，腹部逐渐出现褐斑(图3)，这可能是由于菌丝首先侵入昆虫足部，并吸干足部水分，菌丝开始向外生长，同时侵入桃蚜体表，并在体内开始增殖所导致的。随着进一步的侵染，虫体开始完全变褐，并皱缩干瘪，体表产生大量菌丝(图3)，这可能是因为菌丝侵入体表后大量增殖并快速吸干体内水分及养分造成的结果。

综上所述，刀孢蜡蚧菌HFLP006菌株的产孢量和孢子萌发率均比其他菌株表现优异，且对桃蚜的致死率最高，作用时间最短，因此具有一定的开发为微生物杀虫剂应用于桃蚜的生物防治潜力。