藏红花素抑制AKT和STAT3的活化对黑色素瘤A375细胞裸鼠移植瘤生长、运动及多器官病变的影响

李 媛，李 娜，付文静，舒春梅，张玉杰，马 冲

黑色素瘤是一种由神经嵴衍生的黑色素细胞引发的恶性上皮性肿瘤,多发于皮肤或黏膜，是最常见的皮肤致死性肿瘤之一[1]。黑色素瘤极具侵袭性，对常规放疗和化疗反应较差，导致患者预后不良[2]。虽然已开发出多种靶向药物，但这些药物对黑色素瘤患者的临床疗效改善有限[3]。因此，寻找新的有效的治疗方法是提高患者生存率及降低发病率的重要方式。藏红花素(crocin) 是从鸢尾科番红花属球根类草本植物藏红花(CrocussativusI) 中提取的一种水溶性类胡萝卜素。藏红花素对人类肿瘤具有抗肿瘤活性、明显抑制癌细胞的生长，但对正常细胞没有影响[4]。该研究拟通过以黑色素瘤A375细胞裸鼠模型，探索藏红花素对A375黑色素瘤生长、运动及对肿瘤引起的多器官病变是否存在AKT和STAT3信号通路的参与，以及该通路相关蛋白的表达情况，从而确定新的治疗靶点，以期为藏红花素应用于黑色素瘤的治疗提供理论和实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物选用45只SPF级健康成年雄性Sprague Dawleg(SD)小鼠，鼠龄为5～8个月，体质量180～260 g，饲养于温度23.5～25.6 ℃，相对湿度69%～84%的环境中，饲料与饮水自由摄取。

1.2 主要试剂与仪器藏红花素(美国Sigma公司)；人源性黑色素瘤细胞系A375(中国科学院上海细胞生物学研究所)；10%胎牛血清、无血清细胞冻存(dulbecco modified eagle medium，DMEM) 培养基、0.25%胰蛋白酶(美国Gibco公司)；二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA) 蛋白定量试剂盒(美国PIERCE公司)；MatrigelTM底膜基质(美国BD公司)。Ki-67、Capase-3、VEGE、Vimetin、E-cadherin、N-cadherin、Fibronectin、AKT、p-AKT、STAT3和p-STAT3抗体(美国NEB公司)；HRP标记的山羊抗大鼠二抗(美国Santa Cruz公司)；Olympus BX51光学显微镜(日本奥林巴斯光学有限公司)；ABI StepOnePlus TM荧光定量PCR仪(美国基因仪器公司)。

1.3 皮下移植瘤模型建立将其中36只裸鼠用浓度为75^的酒精消毒皮肤，1 ml注射器吸取0.2 ml(2×106个细胞) A375细胞悬液接种至裸鼠右后肢的背部皮下，每注射2只裸鼠，充分混匀细胞悬液后继续接种，接种完继续饲养。

1.4 实验动物给药剂量与分组建模后，将36只裸鼠随机分为4组(每组9只)，分别为对照组(藏红花素0 mg/kg)、藏红花素低剂量组(藏红花素20 mg/kg)、藏红花素中剂量组(藏红花素50 mg/kg)、藏红花素高剂量组(藏红花素100 mg/kg)。将对照组注射0.1 ml生理盐水于腹腔, 隔日1次, 共7次；其余3组分别腹腔注射0.1ml浓度为20、50、100 mg/kg藏红花素, 方法同对照组。剩余9只裸鼠作为健康对照组，用于HE染色。

1.5 实验方法

1.5.1裸鼠移植瘤生长测定 接种7 d后，选择造模成功的36只裸鼠，给药28 d后各组裸鼠颈椎脱臼处死，剪开皮肤，小心剥离整个瘤块，称重、拍照后用4%多聚甲醛溶液固定，备用。

1.5.2免疫组化分析 采用链霉亲和素-生物素-复合过氧化物酶试剂盒对肿瘤组织中Ki67、Caspase-3、VEGE、Vimetin进行免疫组织化学染色。最后，将载玻片冲洗、脱水并放置在显微镜下检查和计数免疫反应细胞(黄色到棕色)。在与奥林巴斯显微镜相连接的Image-Pro Plus图像分析系统上对异种移植物的免疫染色进行分析。在400×放大倍数下，通过计算黄色到棕色细胞和5个随机选择的视野中的细胞总数来定量Ki67、Caspase-3、VEGE、Vimetin染色呈阳性的细胞。

1.5.3RT-PCR 用TRIzol试剂盒提取各组细胞总RNA。根据逆转录试剂盒说明书合成cDNA，用PCR仪对cDNA进行扩增后用荧光定量试剂盒对进行定量分析。以GAPDH作为内参。反应条件为：95 ℃、反应15 s，总共40个循环，最后60 ℃反应30 s,70 ℃反应30 s。用于该反应的引物信息见表1。

表1 实时定量PCR目的基因的引物

1.5.4HE染色 取部分肝组织、肺组织和肾组织分别放入4%多聚甲醛溶液进行固定，24 h后脱水，石蜡包埋、切片；然后HE染色:将切片分别置于二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ、100%、95%、90%、80%、70%的酒精各10 min，自来水冲洗；苏木精染色、伊红染色；由低到高浓度酒精梯度脱水，二甲苯透明，中性树脂封片；光学显微镜拍照，观察其形态特征。

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1.5.5免疫印迹法 使用裂解缓冲液裂解细胞样品。然后，使用BCA蛋白质测定试剂盒(Beyotime)定量蛋白质浓度。含有20 mg蛋白质的样品在10% SDS-PAGE中分离，然后转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。用5%脱脂牛奶室温封闭蛋白2 h，随后加入一抗(E-cadherin, 1 ∶1 000; N-cadherin, 1 ∶1 000; Fibronectin, 1 ∶1 000; AKT, 1 ∶1 000; p-AKT, 1 ∶1 000; STAT3, 1 ∶1 000；p-STAT3, 1 ∶1 000) 于4 ℃封闭过夜，第2天加入对应二抗室温封闭1 h，最后滴加ECL,设置曝光参数，检测目的条带对应化学发光强弱。

2 结果

2.1 藏红花素对A375黑色素瘤体积和重量的影响与对照组比较，可明显观察到藏红花低、中、高剂量组的黑色素瘤体积减小(图1A)。与对照组比较，藏红花低、中、高剂量组的黑色素瘤的重量均降低(F=73.84，P<0.05)(图1B)。

2.2 藏红花素对黑色素瘤生长的影响藏红花素低、中、高剂量Ki67阳性细胞比率分别为(30.16±2.91)%、(18.67±2.07)%、(13.61±1.82)%， 较对照组(51.13±3.67)% 降低(P<0.05)。对照组可见极少量Caspase-3阳性细胞，藏红花素低、中、高剂量组Caspase-3阳性细胞比率分别为(2.06±1.03)%、(5.24±1.23)%、(17.61±2.62)%，与对照组(0.87±0.23)%比较，均明显增加(P<0.05)。见图2。

图3 不同组Bcl-2、Bax、Survivin mRNA的表达

2.3 藏红花素对黑色素瘤A375细胞运动的影响藏红花素低、中、高剂量组VEGF阳性细胞比率分别为(58.21±5.07)%、(24.91±2.13)% 、(18.31±1.82)% 较对照组(64.21±6.19)%降低(P<0.05)。藏红花素低、中、高剂量组Vimentin阳性细胞比率分别为(47.21±4.07)%、(21.37±1.62)%、(6.34±1.03)% 较对照组(56.26±5.19)%降低(P<0.05)。见图4。

图4 免疫组化检测VEGF和Vimentin的表达 ×400

2.4 藏红花素对黑色素瘤A375细胞上皮间质转化的影响与对照组比较，藏红花素中、高剂量组E-cadherin蛋白表达水平显著升高(F=176.7，P<0.05)，N-cadherin蛋白表达水平降低(F=166.5，P<0.05)；同样，与对照组比较，藏红花素低、中、高剂量组Fibronectin蛋白表达水平降低(F=281.8，P<0.05)，见图5。

图5 E-cadherin、N-cadherin、Fibronectin的蛋白表达

2.5 藏红花素对A375黑色素瘤裸鼠各器官损伤的影响在健康对照组中肝、肺、肾组织结构正常，肝组织中，对照组表现为大面积出血坏死，肝小叶结构受损，炎性细胞浸润明显；与对照组比较，藏红花素低、中、高剂量组肝细胞坏死得以改善，浸润性炎症细胞数量减少，高剂量藏红花(100 mg/kg)治疗改善效果最好。肺组织中，对照组肺脏间质严重水肿，肺泡内出现大量炎性细胞和纤维素样物质沉积，组织局灶性坏死，肺泡壁明显增厚，与对照组比较，藏红花素低、中、高剂量组肺泡内炎性细胞减少，间质水肿减轻，治疗改善效果随藏红花素剂量增加而增加。肾组织中，对照组肾小管萎缩，管腔扩张，间质区域的炎性细胞浸润和纤维化。与对照组比较，藏红花素低、中、高剂量组肾损伤情况得以改善，肾小管萎缩减轻，管腔回收，间质区域的炎性细胞浸润和纤维化程度减轻。见图6。

图6 不同组各器官组织病理学变化 HE染色×400

2.6 藏红花素对AKT和STAT3磷酸化水平的影响与对照组比较，藏红花素中、高剂量组AKT的磷酸化水平降低(F=276.4，P<0.05)，STAT3的磷酸化水平降低(F=327.2，P<0.05)。见图7。

图7 不同组AKT、STAT3蛋白磷酸化水平

3 讨论

黑色素瘤是一种极具侵袭性的癌症，对大多数传统治疗都有抵抗能力。尽管目前治疗黑色素瘤的方法众多，但其预后仍然很差，5年生存率低于5%[5]。由于反应率低且毒性显著，大多数常规化疗药物在黑色素瘤治疗中都失败了。近年来，针对相关基因或通路的靶向治疗明显提高了黑色素瘤患者的生存率[6]，目前研究相对较多的主要是针对BARF、MEK和cKIT的靶向药物，但由于靶向选择的局限性，只对某一部位或者某一类型黑色素瘤有效，选择性太大，以及对靶向药物的原发性或者继发性耐药仍然是棘手的问题[7]。因此，迫切需要寻找新的有效、安全的黑色素瘤治疗方法。

藏红花素具有抗癌活性，通过抑制细胞生长和诱导细胞死亡来抑制肿瘤的生长。研究[8]表明增殖标志物Ki-67在黑色素瘤垂直生长期明显升高，Survivin表达的上调对黑色素瘤细胞的凋亡具有抵抗作用，藏红花素长期治疗能够杀死癌细胞。Wang et al[9]报道称藏红花素可增加Bcl-2/Bax比率，上调Caspase-3诱导皮肤癌细胞凋亡。与前人研究结果一致，本研究显示用藏红花素治疗后，黑色素瘤体积减小，重量减轻，黑色素瘤A375细胞中Ki67阳性细胞数减少，Caspase-3阳性细胞增加，并且下调了Bcl-2/Bax和Survivin mRNA的表达。因此，这表明藏红花素能够抑制黑色素瘤的生长。

黑色素瘤是一种具有高度转移和侵袭性特点的肿瘤。研究[10]发现藏红花素抑制多发性骨髓瘤细胞中VEGF的表达。Festuccia et al[11]报道称藏红花素使前列腺癌细胞中Vimentin蛋白表达明显降低。与前人研究结果相似，本研究发现藏红花素处理的黑色素瘤A375细胞中VEGF和 Vimentin的表达水平明显降低。这表明藏红花素可抑制黑色素瘤A375细胞的侵袭与迁移。

发生上皮间质转化的黑色素瘤细胞失去上皮表型，获得更多间充质细胞样特征，细胞间黏附减少，细胞获得侵袭潜能。研究[12]表明黄芩苷可以降低E-cadherin表达，增加N-cadherin的表达，从而抑制A375细胞EMT的活化。Novak et al[13]证实了黑色素瘤细胞系中Fibronectin的异常表达模式，A375细胞中Fibronectin蛋白表达水平明显高于正常黑色素细胞。与前人研究结果一致，本研究显示藏红花素使黑色素瘤A375细胞E-cadherin蛋白表达明显升高，N-cadherin和Fibronectin蛋白表达明显降低。表明藏红花素可通过抑制EMT相关蛋白的表达，从而抑制黑色素瘤A375细胞的侵袭和迁移。

通过对肝脏、肺脏、肾脏的组织学染色，评估藏红花素对A375黑色素瘤裸鼠各器官损伤的影响。研究显示藏红花素对大鼠肾损伤具有保护作用，藏红花素能减少HS诱导的肺损伤[14]。而由于藏红花素具有较强的抗氧化性能，使用藏红花素治疗可消除丙烯酰胺诱导的肝损伤[15]。本研究表明藏红花素减缓了A375黑色素瘤裸鼠肝脏、肺脏、肾脏的损伤，与前人研究结果一致，表明藏红花素对黑色素瘤A375细胞引起的器官损伤具有一定的治疗作用。

AKT和STAT3信号通路在黑色素瘤的发生和发展过程中发挥着重要作用。研究[12]显示，黄芩苷可以降低A375细胞中p-AKT和p-mTOR的水平。Kim et al[10]使用藏红花素治疗多发性骨髓瘤以剂量和时间依赖的方式降低了STAT3的磷酸化。本研究显示藏红花素明显降低AKT和STAT3的磷酸化水平。因此，藏红花素抑制AKT和STAT3的活性，表明藏红花素可抑制黑色素瘤的发生和发展。