桑葚水提物抑制H2O2诱导BMSCs成脂分化的研究

靳俊峰，刘银花，欧小波，阮 媛，王海青，陈燕玲，吴秀香，易 华

骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)在适当的条件下可分化为骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等，参与组织的修复和再生[1-2]。但机体衰老、氧化应激、雌激素缺乏可削弱BMSCs的定向分化能力，并促使其向脂肪细胞分化，体内脂肪累积则会引发代谢综合征[3-4]。近年来研究表明天然药物小分子可抑制低浓度H2O2引起的BMSCs成脂分化[5-6]。从中医角度讲，BMSCs属于“肾”，是补肾中药作用的一个重要的靶细胞。桑葚是一味重要的补肾中药[7]，但桑葚是否能抑制氧化损伤引起的BMSCs成脂分化并不清楚。该文研究了桑葚水提物对低浓度H2O2引起的BMSCs成脂分化的影响，将有助于从现代生物学角度阐释桑葚的补肾功效。

1 材料与方法

1.1 实验动物SPF级SD雄性大鼠，4周龄，体质量60～80 g，购自广州中医药大学实验动物中心，动物许可证号：SCXK(粤)2013-0034，质量合格证号：44005900002468。室温饲养(22±1) ℃。所有动物实验程序符合《广州中医药大学实验动物伦理委员会章程》。

1.2 试剂与药物DMEM低糖培养基、胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、油红O工作液(美国Abcam公司)；CCK-8试剂盒(LG689)(上海东仁化学科技有限公司)；抗 CD29-FITC、CD44-FITC、CD45-PE-Cy5.5和CD90-PE流式抗体(美国Abcam公司)；Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒(杭州联科生物技术股份有限公司)；桑葚(广州杏园春药房)；Triton X-100(广州健阳生物科技有限公司)；抗-过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferatiors-activated receptors，PPARγ)(H-100)、抗-CCAAT/强子结合蛋白α(CCAAT enhancer binding proteins，C/EBPα)(D-5)(美国Santa Cruz公司)；Alexa Fluor 555标记驴抗兔IgG、4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)(上海碧云天生物技术有限公司)。

1.3 主要仪器SHZ-D(III)循环水式真空泵(巩义市予华仪器有限责任公司)；旋转蒸发器RE52C(上海亚荣生化仪器厂)；FD系列冷冻干燥机FD-1A-50(上海汉诺仪器有限公司)；PerkinElmer EnSpire多功能酶标仪(上海珀金埃尔默管理有限公司)；流式细胞仪(BD Accuri C-5)。

1.4 检测指标与方法

1.4.1流式细胞术鉴定BMSCs 颈椎脱位法处死大鼠，分离股骨，暴露骨髓腔，DMEM低糖培养基吹打骨髓腔。1 000 r/min离心骨髓冲洗液8 min，弃上清液，重悬，接种培养瓶，37 ℃、5% CO2培养箱中培养，传代，P3代BMSCs用于后续实验。常规消化、离心，调整细胞密度为1.0×106，分为空白对照组、同型对照组和实验组。吸细胞悬液50 μl加CD29-FITC、CD44-FITC、CD45-PE-Cy5.5和CD90-PE等5 μl。避光孵育30 min，洗2遍。离心弃上清液，重悬，检测。重复3次，Flow Jo 7.6软件分析数据。

1.4.2真空冷冻干燥法制备桑葚水提物 称桑葚10.659 8 g，加200 ml双蒸水，煮沸30 min。布氏漏斗减压抽滤，旋转蒸发器将滤液分离。冷冻干燥机-53.4 ℃、-20 MPa抽真空，冷冻干燥，称量。

1.4.3CCK-8检测桑葚水提物对BMSCs生长的影响 P3代BMSCs以1×104/ml接种于96孔板，加100 μl BMSCs悬液，培养。24 h弃培养基，分组：正常对照组(DMEM低糖培养基培养)、桑葚水提物(15、30、60 mg/L)，空白对照组调零，每组5个复孔。24 h弃培养基，加CCK-8工作液10 μl，培养1 h，检测。

1.4.4油红O染色检测及半定量分析 P3代BMSCs以1×104/ml接种于有无菌圆载玻片的24孔板，培养。PBS配100 μmol/L的H2O2诱导液，作用1 h。分为H2O2模型组、桑葚水提物(15、30、60 mg/L)组，正常培养的BMSCs为对照组。4%多聚甲醛固定30 min；洗3次，每孔加入500 μl油红O工作液，25 min后60 %异丙醇洗1次，双蒸水洗3次；苏木精染色15 s，水洗3次，封片。随机选取5个高倍视野，计数阳性细胞，统计学处理。

1.4.5免疫荧光检测PPARγ和C/EBPα的表达 P3代BMSCs以1×104/ml接种100 μl于有无菌圆载玻片的24孔板，分为对照组、H2O2模型组、桑葚水提物(60 mg/L)组。细胞接近长满4%多聚甲醛固定30 min。PBS洗3次。0.3% Triton X-100室温30 min，洗3次，5% BSA封闭30 min，弃封闭液，加I抗PPARγ(1 ∶100)、C/EBPα(1 ∶100)，4 ℃孵育过夜，洗3次×5 min/次，加II抗Alexa Fluor 555标记的驴抗兔IgG(1 ∶200)避光孵育30 min，洗3次，DAPI(1 ∶1 000)染3 min。洗3次，封片，PBS替代I抗作为阴性对照。

1.4.6Western blot检测PPARγ和C/EBPα P3代BMSCs以1×104/ml接种1 ml于6孔板，分对照组、H2O2模型组、桑葚水提物(60 mg/L)组。细胞接近长满后预冷PBS洗2遍，加入裂解液(RIPA ∶PMSF=100 ∶1)，收集细胞，冰上裂解30 min，超声5 min，12 000 r/min离心10 min，取上清液，CA蛋白定量将样品浓度调整一致后煮沸。蛋白30～50 μg电泳；转PVDF膜，封闭2.5 h，I抗4 ℃过夜；TBST洗6次，II抗孵育1 h；TBST洗6次，曝光，Image J软件分析，统计学处理。

2 结果

2.1 BMSCs形态学观察及鉴定原代细胞24 h贴壁，图1A显示，P1代呈长梭形，早期混杂有杂细胞，换液、传代去除，图1B显示P3代已较纯。流式细胞术图1C显示，高表达CD44(99.20%)、CD29(99.02%)和CD90(99.94%)，低表达CD45(6.41%)。

2.2 桑葚水提物对正常BMSCs生长的影响称量桑葚10.659 8 g，真空、低温、冷冻、干燥得桑葚水提物6.262 6 g，提取率58.75%。高、中、低剂量(15、30、60 mg/L)作用于BMSCs，24 h酶标仪检测，统计学处理，表1显示，15、30、60 mg/L桑葚水提物对BMSCs的生长与正常对照组BMSCs生长相比差异无统计学意义(P>0.05)。

表1 桑葚水提物对大鼠BMSCs生长的影响

2.3 桑葚水提物对H2O2刺激后BMSCs成脂分化的影响油红O染色将脂肪染成深红色。图2显示，对照组染色阴性；模型组较多深红色阳性产物；15 mg/L桑葚水提物组脂滴生成无影响；30 mg/L桑葚水提物组脂滴减少；60 mg/L桑葚水提物组抑制脂滴生成。

计数各组阳性细胞数，图3统计学分析显示：模型组与正常对照组差异有统计学意义(P<0.01)，模型组与15 mg/L组差异无统计学意义(P>0.05)，这两组与30、60 mg/L两组相比，差异均有统计学意义(P<0.05)；30 mg/L组与60 mg/L组差异有统计学意义(P<0.05)，60 mg/L桑葚水提物对成脂分化抑制作用最大，后续实验均采用此浓度。

图1 大鼠BMSCs的培养和鉴定 ×200

2.4 桑葚水提物对H2O2刺激后BMSCs胞质内PPARγ和C/EBPα表达的影响图4显示，PPARγ和C/EBPα阳性产物呈红色，对照组PPARγ和C/EBPα无表达，模型组表达，60 mg/L桑葚水提物组表达减少。图5显示，Western blot结果与上述结果具有一致性，模型组与60 mg/L桑葚水提物组相比，PPARγ和C/EBPα表达差异均有统计学意义(P<0.05)。

图2 桑葚水提物抑制H2O2刺激后BMSCs成脂分化油红O染色×400

图3 桑葚水提物减少H2O2刺激后BMSCs成脂分化细胞数

3 讨论

真空冷冻干燥是利用升华的原理使物质脱水的一种干燥技术，该方法所得的活性成分含量与新鲜样品最接近[8]。本研究将桑葚水提物进行真空冷冻干燥，最大程度的保留了桑葚的有效成分，提取率较高。本课题组前期使用高效液相色谱分析表明，桑葚水提物中含有5种黄酮类化合物(桑色素、芦丁、紫云英苷、异槲皮素、木犀草素)和2种非黄酮类化合物(绿原酸、桑橙素)，这7个化合物分子骨架不尽相同，但都含有酚羟基，其中，芦丁、紫云英苷、异槲皮素、木犀草素、绿原酸、桑橙素含有强抗氧化活性的邻二酚羟基结构，而邻二酚羟基被认为是细胞保护作用的重要来源[9]，本结果说明上述桑葚水提物中的主要有效成分协同发挥调节作用，实现对·OH损伤的间充质干细胞保护作用，这与本课题组前期的研究[10]结果是一致的。

图4 免疫荧光检测各组PPARγ和C/EBPα的表达 ×400

图5 Western blot法检测各组PPARγ和C/EBPα的表达水平

氧化应激可使细胞产生大量的自由基，过量自由基会导致细胞衰老、癌变或功能异常。本实验中使用的细胞是全骨髓法获取的BMSCs，P3代细胞经流式细胞术检测显示，已经较为纯化，可用于后续实验，与文献[11]报道相一致。本项目组前期发现100 μmol/L H2O2氧化损伤BMSCs后对细胞生长无抑制，但可促进细胞成脂分化[12]，本实验继续采用这种低浓度H2O2诱导的细胞模型进行实验。油红 O具有很强的染脂质作用，可以将细胞或组织内的脂质染成红色。本实验结果显示，随着桑葚水提物浓度的增加，其对H2O2诱导后的BMSCs脂滴生成抑制作用增强，具有量效关系，可见，桑葚水提物对氧化损伤的BMSCs有保护作用，有助于维持BMSCs的干细胞状态。

PPARγ和C/EBPα是细胞成脂分化的两个关键转录因子，目前的研究[13-14]显示，PPARγ和C/EBPα可通过协同作用来影响3T3-L1 前脂肪细胞向脂肪细胞的分化，有报道[6-7]显示，芥子碱、白术内酯Ⅲ、穿心莲内酯等中药有效成分可通过抑制PPARγ和C/EBPα的表达抑制H2O2诱导后BMSCs中脂滴形成。本研究结果显示，正常BMSCs中PPARγ和C/EBPα无表达，H2O2刺激后BMSCs中PPARγ和C/EBPα的表达均增加，60 mg/L桑葚水提物则可抑制模型细胞中PPARγ和C/EBPα的表达，与文献报道具有一致性，提示桑葚水提物可通过抑制PPARγ和C/EBPα的协同表达抑制H2O2诱导后BMSCs成脂分化。

综上所述，桑葚水提物对正常的BMSCs生长并无影响，对H2O2损伤的BMSCs有保护作用，可通过抑制PPARγ和C/EBPα的表达而减少H2O2诱导后BMSCs内脂滴的生成，有助于维持BMSCs的干细胞特性，本研究结果从现代生物学的角度阐释了补肾中药桑葚对其靶细胞BMSCs的调控。