绿原酸抑制TLR4/NF-κB通路诱导巨噬细胞源性泡沫细胞凋亡的进展分析

罗南 叶蔚 俞蕾敏

[摘要] 绿原酸是中药金银花当中的主要成分，對于炎症反应的抑制可以起到一定的作用和效果。绿原酸对于巨噬细胞模型上具备抗炎活性的作用，本文先就绿原酸在巨噬细胞源性泡沫凋亡当中的诱导作用进行分析，总结当前学者在这方面的研究进展，为之后的后期研究奠定理论基础。

[关键词] 绿原酸;TLR4/NF-κB通路;诱导作用;巨噬细胞;源性泡沫细胞

[中图分类号] R285          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-9701（2020）15-0189-04

Analysis on the progression of macrophage-derived foam cell apoptosis induced by chlorogenic acid inhibition of TLR4/NF-κB pathway

LUO Nan1， 2   YE Wei2   YU Leimin2

1.Zhejiang University of Traditional Chinese Medicine，Hangzhou  310053，China; 2.Department of Gastroenterology， Hangzhou Hospital of Traditional Chinese Medicine， Hangzhou   310007，China

[Abstract] Chlorogenic acid is the main component of honeysuckle as a traditional Chinese medicine， which can play a certain role in the inhibition of inflammatory reaction. Chlorogenic acid has anti-inflammatory activity in macrophage model. In this paper， the induction of chlorogenic acid in macrophage-derived foam cell apoptosis was firstly analyzed， and the current research progress achieved by various scholars in this field was then summarized so as to lay a theoretical foundation for the later research.

[Key words] Chlorogenic acid; TLR4/NF-κB pathway; Induction; Macrophage; Derived foam cell

我国心血管疾病在近些年来的发病率呈明显的增加趋势。动脉粥样硬化是心血管疾病发生的关键诱导因素之一，其形成又与巨噬细胞源性泡沫细胞之间存在着十分密切的相关性[1]。为了探讨巨噬细胞源性泡沫细胞在动脉粥样硬化过程中所起到的作用以及绿原酸所起到的抑制作用开展了本次分析。在研究中主要介绍了绿原酸基本内容、巨噬细胞源性泡沫等，分析绿原酸的作用以及该物质对于巨噬细胞源性细胞凋亡的作用和进展。本文现结合已有学者开展研究所得到的结果为依据进行详细论述。

1 绿原酸基本内容与巨噬细胞源性泡沫细胞介绍

1.1 巨噬细胞源性泡沫细胞基本内容

在摄入了大量的氧化低密度蛋白之后，巨噬细胞中会蓄积很多的脂质细胞，长时间积累会让巨噬细胞负荷过度导致出现泡沫细胞。泡沫细胞在形成之后也为之后出现动脉粥样硬化情况奠定了基础，也被认为是动脉粥样硬化的早期步骤和重要标志[2]。在已有的文献当中报道显示，想要延缓动脉粥样硬化在早期出现的病变，可以加速泡沫细胞的凋亡，也就是巨噬细胞凋亡的速度越快，动脉粥样硬化发展的速度也就越慢。因此想要减少动脉粥样硬化的病灶，或者延缓动脉粥样氧化疾病的发展进程，这就需要减弱对巨噬细胞的抑制作用，加快巨噬细胞的凋亡。

TLR4即toll样受体4，这一物质存在于细胞膜上，在炎症反应、先天免疫以及获得性免疫当中均起到了十分关键的作用。已有的研究结果发现，TLR4在源性泡沫细胞形成的过程中，其表达水平会呈现出很明显的升高趋势[3]，表明在动脉粥样硬化当中。如果TLR4参与其中会让泡沫细胞的炎性反应能力得到提升。这间接表明了想要防止动脉粥样硬化情况的出现，可以降低TLR4的表达水平。

1.2 绿原酸基本内容

绿原酸是金银花当中的重要构成部分，而金银花本身则具有抗菌消炎作用。在相关学者的报道结果中发现，采用中药，包含金银花在内的中药构成的方剂对于动脉粥样硬化易损斑块的稳定性具有比较好的作用[4]，之所以会起到稳定斑块的作用，很可能是因为其中包含的成分与抑制炎性反应之间存在关系。学者通过研究发现[5-6]，绿原酸在巨噬细胞中具有比较明显的抗炎活性作用，起到抗炎作用的主要原因与机制还是因为帮助促进NF-κB水平的降低来实现的，当然也会受到抗氧化酶的活性。研究理论成果体系当中还比较缺少绿原酸与泡沫细胞之间的相关性分析，因此本次开展这方面研究可以起到填补理论空白的作用。

2 绿原酸对巨噬细胞源性细胞凋亡的作用及进展

2.1 绿原酸的作用分析

绿原酸可以对细胞起到一定的调控作用，也有不少学者在研究当中对绿原酸的作用进行分析还得到相应的研究成果。刘娴等[7]分析了杜仲绿原酸（CA）对脂多糖（LPS）诱导的视网膜内皮细胞（HRECs）凋亡和炎症反应的影响，结果显示绿原酸通过抑制NF-κB P65活化减弱LPS诱导的HRECs细胞凋亡和炎症反应的增强。苏国莹等[8-9]对咖啡酸和绿原酸抑制AGEs诱导的炎症反应进行描述，考察AGEs-BSA、咖啡酸、绿原酸的合理作用浓度范围，构建HUVEC炎症反应体系。霍晓芳等[10-12]分析了绿原酸对于脂多糖的诱导，对于巨噬细胞所产生的影响，认为绿原酸之所以具备抗炎作用，可能与能够促进NF-κB p65的水平的降低，对于一氧化氮的表达起到抑制作用有关，也可能是因为让抗氧化酶活性出现了明显增加的关系。张洁琼等[13]研究认为拉帕替尼与绿原酸联合应用对于巨噬细胞的M2性极化以及抗乳腺癌转移可以起到比较好的作用。

2.2 绿原酸对于巨噬细胞源性细胞凋亡的影响及作用

2.2.1 实验设计和开展  有学者对于绿原酸在巨噬细胞源性细胞凋亡当中的作用开展了相关的试验，而且也得到了具体的研究成果[14-15]。研究对象选择8周龄的小鼠，实行安乐死。在腹腔当中注射RPMI，剂量为8 mL进行灌洗，对腹腔巨噬细胞进行收集，然后再采用青-链霉素来进行培养，时间为4 h，非贴壁细胞采用PBS来将其洗掉，巨噬细胞采用oxLDL预处理1 h。在对巨噬细胞的活性进行检测时采用MTT法，等细胞贴壁之后，再对巨噬细胞采用L0×LDL来进行预处理，将不同浓度的绿原酸加入其中，培养2 d。在37℃的环境下，加入MTT溶液，孵育4 h，将孔中的液体都移除，将DMSO加入其中，溶解细胞当中的MTT结晶。细胞凋亡所采用的方法是流式细胞式检测，在接受预处理之后再加入不同浓度的绿原酸，接受49 h的培养，按细胞凋亡检测的试剂盒说明书完成操作。

2.2.2 相关机制分析  通过研究发现，动脉粥样硬化是心血管疾病的所有病变当中最容易发生的病变[16]。动脉脂质斑块是因为脂质沉积所导致的，一般包含了参与到炎症反应当中的白细胞、內皮细胞以及泡沫细胞等构成。在关于动脉粥样硬化的相关原因分析当中可以发现，巨噬细胞作为动脉粥样硬化的高危影响因素是最早被发现的。巨噬细胞在动脉粥样硬化发生病变的过程中，会产生不同数量的促炎症因子，这些因子可以参与到脂质沉积当中，还会表达模式识别受体，所识别的受体有Toll样受体和清道夫受体等[17]。研究中发现，在巨噬细胞源性泡沫细胞的形成过程中，TLR4的表达水平会呈现出十分明显的升高趋势，这一结果也证实了泡沫细胞和TLR4水平之间存在着一定的关系。TLR4水平对于炎症信号通路会起到调控和激活的作用，导致病变部位的不断加重，进一步诱发病变部位出现更严重的炎性反应，导致病变不断恶化。所以，在动脉粥样硬化疾病的预防和治疗过程中就需要最大限度减少TLR4表达水平，促进源性泡沫细胞的数量降低[18]。

有学者在研究当中提出了假说，即在泡沫细胞的形成过程中，OxLDL起到了十分重要的作用，如影响到一氧化碳信号通路情况和白细胞聚集黏附因子的释放也会产生影响[19]。在黏附蛋白多糖的作用下，血管内膜中会进入低密度脂蛋白，促进氧化修饰过程的有效完成。在修饰了脂质之后，便可以相应地诱导巨噬细胞，血管壁细胞释放粘附因子，对于释放炎症因子也会起到诱导作用，触发体内的炎症反应，加重患者体内的脂质斑块损伤程度，让动脉粥样硬化的程度不断加重。金银花是我国中药中具有清热解毒作用的中药，在抗菌消炎当中绿原酸起到了十分重要的作用。在文献中指出，在巨噬细胞模型当中，绿原酸具备了抗原活性，能帮助NF-κB表达水平的降低，也会对一氧化碳的释放起到抑制作用。激活了TLR4信号通路之后，MyD88蛋白会和TLR4结合起来，形成十分重要的复合体，将体内的其他物质激活，对于NF-κB水平的降低需要先降解IκB。

2.2.3 绿原酸对凋亡细胞的调控作用研究进展   关于绿原酸对于细胞凋亡的诱导作用相关研究已经取得了不小的进展，在对已有学者开展研究结果的汇总分析当中选择了比较具有代表性的观点进行分析。其中林茂等[20]研究绿原酸（CGA）对β淀粉样蛋白_（25-35）（Aβ_（25-35））诱导的PC12细胞凋亡的保护作用和机制，20 μmol/L的Aβ_（25-35）诱导PC12细胞构建细胞损伤模型，并以5个不同浓度CGA干预，CCK-8法检测细胞存活率以确定后续实验CGA的3个浓度。随后，细胞随机分为Control组、Model组及3个浓度CGA组。最终得到结论，认为绿原酸对于所选择的这种细胞凋亡具有比较好的改善作用，还可以帮助细胞抗氧化能力的改善，线粒体也会受到一定的损伤。刘哲等[21]研究了骨髓间充质细胞来源软骨样细胞的相关内容，分析了绿原酸对于此种细胞所产生的影响以及具体的影响机制，在实际开展研究当中对大鼠的间充质肝细胞采用体外培养的方式，借助于诱导液（包含有0.2 mg的L-1 BMP-2），让细胞变成软骨样细胞之后再开展进一步的研究，分为（A）正常对照组、（B）绿原酸组、（C）0.1%O2缺氧环境组、（D）绿原酸+0.1%O2缺氧环境组。最终通过试验发现，缺氧环境组中绿原酸所起到的作用比较明显，也就意味着在缺氧环境下对于软骨样细胞凋亡的诱导作用十分明显，产生诱导作用的机制可能是因为能够让细胞当中的活性氧水平降低，对线粒体膜电位可以起到比较好的保护作用，对于Caspase-3的表达产生抑制作用，对于凋亡抑制基因也可以起到促进作用[22-23]。李欣颖[24]研究分析了酰基化ghrelin对棕榈酸诱导的人源单核巨噬细胞（THP-1巨噬细胞）TLR4/NF-κB信号通路的作用用不同浓度的棕榈酸（100 μmol/L、200 μmol/L、500 μmol/L）孵育THP-1巨噬细胞株12 h;用不同浓度的酰基化ghrelin（1 nmol/L、10 nmol/L、100 nmol/L）孵育THP-1巨噬细胞株4 h后，再加入棕榈酸（200 μmo1/L）孵育12 h，测定结果。最终通过研究发现，巨噬细胞TLR4/NF-κB上信号通路的活化而促进炎症因子分泌不仅仅会受到绿原酸的影响和调控，同时还会受到棕榈酸的影响与调节。

在对与绿原酸抑制TLR4/NF-κB通路诱导巨噬细胞源性泡沫细胞凋亡作用的相关内容进行分析的过程中发现与此相关的研究成果的确是很少见，而林庆新[25]在这方面所开展的研究比较完整，分析也更加全面一些。其以氧化低密度脂蛋白（OxLDL）诱导小鼠腹腔巨噬细胞为巨噬细胞源性泡沫细胞，不同浓度的绿原酸对源性泡沫细胞的影响进行对比分析，还借助流式细胞术的方式来分析细胞凋亡程度和绿原酸之间的关系。用Western Blot法检测绿原酸对凋亡相关蛋白表达的影响，最终通过研究发现在巨噬细胞源性泡沫细胞生长当中绿原酸能够起到比较好的诱导凋亡作用，表明在动脉粥样硬化的预防与治疗中可以考虑绿原酸的作用。

综上所述，导致心血管疾病发生的重要原因之一就是动脉粥样硬化，而巨噬细胞源性泡沫细胞与动脉粥样硬化之间又存在着十分密切的相关性。在临床上想要更好地预防与治疗心血管疾病，从根本上看需要控制好巨噬细胞源性泡沫细胞的生长，已有的研究证明了绿原酸对于巨噬细胞源性泡沫细胞的凋亡可以起到比较好的帮助作用，减少动脉粥样硬化病灶的数量，也可以帮助延缓病程发展的速度，让患者的生存率得到提升。

[参考文献]

[1] 徐静红，毛艳菲.绿原酸对脂多糖诱导的急性肾损伤小鼠的保护作用[J].医药导报，2019，（7）：860-864.

[2] 梁彩虹.基于调控TLR4/NF-κB信号通路的PTPRO影响动脉粥样硬化机制及冠心病PCI术后患者氯吡格雷抵抗中医舌诊研究[D].南京：南京中医大学，2017.

[3] 单建华.绿原酸对LPS诱导的RAW264.7细胞中COX-2蛋白表达的影响及其机理研究[D].南京：南京师范大学，2009.

[4] 田伟，豆亚伟，王宏涛，等.绿原酸诱导肺癌细胞凋亡及其机制研究[J].解放军预防医学杂志，2016，（6）：854-857.

[5] 周静，赵宏，秦书俭，等.绿原酸对Aβ25-35诱导的大脑皮层细胞损伤的保护作用机制[J].中国临床解剖学杂志，2014，14（3）：316-320.

[6] Su HW，Yang JM，Han B，et al.Chlorogenic acid methyl ester exerts strong anti-inflammatory effects via inhibiting the COX-2/NLRP3/NF-κB pathway[J]. Food & Function，2018，9（12）：6156-6165.

[7] 刘娴，姜玉珍，田聘，等.杜仲绿原酸对LPS诱导的视网膜内皮细胞凋亡和免疫反应的调控作用[J].中国免疫学杂志，2019，35（2）：49-53，58.

[8] 苏国莹.咖啡酸和绿原酸抑制AGEs诱导的炎症反应[D].广州：华南理工大学，2018.

[9] Zheng SQ，Huang XB，Xing TK，et al. Chlorogenic acid extends the lifespan of caenorhabditis elegans via Insulin/IGF-1 signaling pathway[J].The Journals of Gerontology.Series A. Biological Sciences and Medical Sciences，2017，72（4）： 464-472.

[10] 霍晓芳，唐彦萍，张庆军，等.绿原酸对脂多糖诱导的巨噬细胞的影响[J].遵义医学院学报，2003，26（6）：507-508.

[11] 杨洋，李觉.绿原酸通过PI3K/Akt信号通路抑制异丙肾上腺素诱导的心肌肥大[J].同济大学学报（医学版），2019，40（2）：184-189.

[12] Zhang Y，Yan H，Lei JY，et al. Chlorogenic acid alleviates autophagy and insulin resistance by suppressing JNK pathway in a rat model of nonalcoholic fatty liver disease[J]. Journal of Biosciences，2018，43（2）：287-294.

[13] 张洁琼，姚张婷，梁桂开，等.拉帕替尼与绿原酸联合应用抑制巨噬细胞M2型极化及抗乳腺癌转移的作用研究[J].浙江大学学报（医学版），2015，11（5）：9-10.

[14] 罗元一，殷明，邬亚华，等.绿原酸对过氧化氢诱导大鼠髓核细胞凋亡保护作用的研究[J].中成药，2013，35（4）：656-660.

[15] Wang S，Zhang XY，Cheng D，et al. Chlorogenic acid protects against aluminum toxicity via MAPK/Akt signaling pathway in murine RAW264.7 macrophages[J]. Journal of Inorganic Biochemistry：An Interdisciplinary Journal，2019，19（10）： 113-120.

[16] 卞合涛.绿原酸对过氧化氢诱导内皮细胞凋亡的保护作用[J].中国药理学通报，2010，26（12）：1587-1590.

[17] 朱泽欣，赵云涛，陈绍红，等.构树绿原酸样化合物诱导胃癌细胞凋亡的机制研究[J].中草药，2018，49（22）：120-126.

[18] 申茹，徐英辉，刘彦彦，等.基于SIRT1/HO-1途径研究绿原酸诱导人肝癌细胞HepG2凋亡的作用机制[J].中药药理与临床，2017，10（2）：30-33.

[19] 刘云龙，宋卓，彭冰潔，等.绿原酸对高脂饲粮诱导非酒精性脂肪肝大鼠细胞凋亡相关基因表达的影响[J].动物营养学报，2015，27（7）：2140-2149.

[20] 林茂，王敏，刘芳，等.绿原酸对Aβ_（25-35）诱导的PC12细胞凋亡的保护作用[J].实用医学杂志，2017，10（12）：21-24.

[21] 刘哲，李士勇，宋玉林，等.绿原酸对缺氧环境下干细胞来源软骨样细胞凋亡的影响[J].中国药理学通报，2011， 27（2）：206-210.

[22] 胥亚.TLR4/NF-κB通路在oxLDL/β2GPI/anti-β2GPI复合物诱导小鼠巨噬细胞泡沫化中的作用探讨[D].镇江：江苏大学，2014.

[23] Jiang WB，Cao JK，Wang XM，et al. Chlorogenic acid induces resistance against Penicillium expansion in peach fruit by activating the salicylic acid signaling pathway[J]. Food Chemistry，2018，260（15）：274-282.

[24] 李欣颖.酰基化ghrelin对棕榈酸诱导的THP-1巨噬细胞TLR4/NF-κB信号通路活化的作用[D].长沙：中南大学，2012.

[25] 林庆新.绿原酸抑制TLR4/NF-κB通路诱导巨噬细胞源性泡沫细胞凋亡[J].北方药学，2019，16（8）：123-126.

（收稿日期：2019-12-04）