支气管肺泡灌洗液GM试验对慢性肺曲霉病的早期诊断及疗效评估价值

苏铎华 汤春梅 邝浩斌 肖海浩 李宇 张言斌

肺曲霉病不仅好发于免疫抑制人群，近年来的研究也发现非免疫抑制人群罹患肺曲霉病也逐年增多，慢性肺曲霉病(CPA)是肺曲霉病中发病率仅次于侵袭性肺曲霉病(IPA)，其好发于有肺部基础疾病的患者，如空洞型结核病，COPD，肺囊性纤维化，非结核分枝杆菌肺病等，据统计中国CPA的5年流行率为16.7%。有研究显示，CPA确诊6个月死亡率超过15%[1]，其中CNPA(慢性坏死性肺曲霉病)的死亡率超过50%[2]，因此早期诊断和及时有效治疗显得尤为重要。由于CPA没有特异性的临床特征，其确诊主要依靠组织病理学，早期易漏诊甚至误诊。国内外文献报道，BALF-GM检测在肺曲霉病的早期诊断具有重要的价值，其特异性及敏感性均高于血清GM检测，本研究比较了CPA患者血清GM及BALF-GM的诊断效能以及BALF-GM在治疗中的变化，现将结果报告如下。

资料与方法

一、研究对象

选取2017年1月至2018年12月在广州市胸科医院肺结核科住院并初步诊断为疑似CPA患者155例作为研究对象，其中男120例(占77.4%)，女35例(占22.6%)，男/女性别比为3.43(120/35)。纳入标准：1)具有疑似肺曲霉病的临床特征及影像学特点，如咳嗽，咳痰、咯血、胸痛、发热或查体有肺部啰音，胸片或CT提示新月征或晕轮征等。2)患者无免疫功能抑制或轻度免疫功能抑制；3)患者均签署支气管镜知情同意书。排除标准：1)粒细胞缺乏患者(中性粒细胞绝对值<0.5×109/L)2)骨髓移植或实体器官移植术后(如心、肝、肾等)；3)HIV感染；4)合并严重器官功能障碍(心、肝、肾等)；5)严重精神障碍；6)存在不能耐受支气管镜检查等其他情况。

二、分组

依据2015年ESCMID《慢性肺曲霉病的诊断与治疗临床指南》[3]制定的CPA诊断标准，即需符合以下条件：1)胸部影像学特征性表现；2)曲霉感染的直接依据或针对曲霉免疫反应结果阳性；3)除外其他疾病，病程大于3月。CPA的诊断分级则按照2008年EORTC/MSC修订的[4]以及2016年IDSA修改的曲霉病的诊断及分级方法[5]，具体为：①确诊诊断：组织病理学证实，无需宿主因素及临床特征，或至少有一项宿主因素及一项临床特征或2项次要临床特征，且血液培养或无菌液培养为真菌；②临床诊断：同时满足宿主因素、临床特征、微生物依据；③拟诊诊断：同时满足宿主因素及临床特征，无微生物学依据。

155例患者最后有75例确诊为CPA(无临床诊断及拟诊诊断者)，将确诊的患者纳入观察组(n=75)。将确诊为非CPA患者归入对照组(n=80)，对照组患者经组织病理或微生物学排除曲霉菌感染，并随访三月无真菌感染表现。

三、方法

1 采集标本：完善胸部CT检查确定肺部病灶的部位及范围，排除支气管镜禁忌症后，观察组及对照组病人均按支气管镜的常规操作进行检查，将纤维支气管镜嵌入病变部位及所在的支气管亚支、引流的空洞，注入灭菌盐水20mL后进行冲洗并取前端部位行病原微生物检查，然后再经支气管镜注入37oC灭菌生理盐水60～80mL进行支气管肺泡灌洗，用合适的负压进行回收吸引，回收率>30%。同时对病变组织进行病理活体组织检查。两组患者同时采集血清GM检测，观察组在治疗的第一个月，第三个月再次采集BALF进行GM检查。

2 微生物学及病理学检查：病例组及对照组患者按病情不同分别进行支气管冲洗液真菌及致病菌培养，病变部位病理学检查。

3 GM试验 对所有患者的BALF分别进行GM试验检测(ELISA法)，按照我院的诊断界值(0.9)进行阳性及阴性判定，并记录其结果；同时对所有患者行血清GM检查(ELISA法)，按照我院的诊断界值(1.0)进行阳性及阴性判定，并记录结果。对观察组患者治疗前、治疗后第一、三月的BALF-GM值进行记录。

四、统计学方法

结 果

一、临床资料

观察组75例，所有患者均行支气管镜坏死物活检或黏膜活检，组织病理学均确诊为曲霉菌感染，对照组80例，均经临床排除曲霉菌感染。观察组患者基础疾病以陈旧性肺结核为主，占94.7%(71/75)，另外支气管扩张、COPD等均占比较高，对照组患者中活动性肺结核占65.0%(52/80)，两组病人的基础疾病(见表1)，差异无统计学意义(P>0.05)。

表1 两组患者基础疾病情况[n(%)]

二、观察组与对照组的GM值比较,观察组及对照组的BALF-GM值分别为4.13±2.39及0.19±0.13，血清GM则分别为 0.57±1.15及0.09±0.01。观察组两个部位的GM结果均明显高于对照组，差别有统计学意义(P<0.05)(见表2)。

表2 观察病例组与对照组的BALF-GM结果比较

三、以我院GM的诊断界值作为参考，以BALF-GM≥0.9为阳性界值，观察组阳性有65例，而对照组则有5例(见表3)，差异有统计学意义(P<0.05)。以血清GM以≥1.0为阳性界值，病例组中血GM阳性有7例，对照组为1例(见表4)，差异无统计学意义(P>0.05)。

表3 两组患者BALF-GM比较

表4 两组患者血清GM比较

四、BALF-GM与组织病理学诊断CPA的结果比较

观察组患者所有患者均行支气管镜检查及组织活检，并以支气管镜病理活检结果为“曲霉感染”为确诊的金标准，最终全部患者均为组织病理学确诊，无临床诊断或拟诊患者。确诊患者中BALF-GM≥0.9的有65例。根据BALF-GM的结果，并按GM≥0.9为诊断阈值，其诊断符合率为86.67%(65/75)。

五、BALF及血清诊断CPA的诊断效率对比，BALF-GM的灵敏度及阴性预测值均明显高于血清GM，而特异度及阳性预测值方面两者差异不大，其中两组数据中灵敏度及阴性预测值的差异对比有统计学意义(P<0.05)(见表5)。

表5 BALF-GM及血清GM诊断CPA对比

设定BALF-GM在不同界值下计算其灵敏度，特异度，并描绘ROC曲线，可见当BALF-GM的界值为0.765时，诊断效率最高。此时AUC面积为0.962，BALF-GM诊断CPA的灵敏度为86.57%，特异度为88.75%(见图1)。

图1 BALF-GM诊断CPA的ROC曲线(箭头所指为各点界值)

六、治疗与转归

观察组75个病人有61人(81.3%)第三个月检测BALF-GM可降至0.9的阈值以下。75例患者中坚持使用抗真菌治疗半年及气管镜下清除曲菌球治疗的有67例，随访有57例病情稳定。

讨 论

曲霉菌是自然界正常存在的微生物，肺部是其最常见的致病部位之一。随着近年来非免疫抑制人群以及结构性肺疾病(如COPD、支气管扩张、陈旧性肺结核等)人群的逐渐增多，慢性肺曲霉病(CPA)的发病率也在增加。我们的研究中也证实了这一点，(表1)显示了病例组患者中基础病多为陈旧性肺结核(占94.7%)等结构性肺疾病。据国外一项统计，不经过治疗的CPA患者，5年内死亡率超过50%，因此，及时的诊断和治疗对降低CPA的死亡率尤为关键。大部分CPA患者多合并肺部结构破坏，支气管扭曲变形，局部纤毛摆动能力较差，由于CPA的临床表现无明显特异性，加上某些危重病例取病理活检确诊难度大，真菌培养时间较长，灵敏度低，这些均增加了早期诊断CPA的难度。

半乳甘露聚糖(GM)是曲霉菌的细胞壁比较特异的多糖部分，感染早期即可进入人体血液及体液，并持续1～8周。目前临床上可通过血液、支气管肺泡灌洗液，胸水、脑脊液及肺组织等检测GM，是诊断真菌感染的常见抗原之一。已有大量的研究表明，BALF检测GM的敏感性、特异性及阳性预测值等均要优于血清GM[6-8]。BAL(支气管肺泡灌洗术)是借支气管镜将生理盐水灌注到目标支气管，使生理盐水充满肺泡后再回收其肺部表面物质进行检测(用于诊断)，并可清除填充于肺泡表面的物质进行治疗的一种内镜诊疗技术[9]。本研究的表5可看出，BALF-GM诊断CPA方面，灵敏度(86.67%)与阴性预测值(88.23%)均明显高于血清GM值，后者仅为9.33%及53.74%，但特异度及阳性预测值两组对比无明显差异(P>0.05)，这与既往有些研究稍有出入，究其原因，这可能与研究对象不同有关，既往对BALF-GM的研究对象多是侵袭性肺曲霉病(IPA)，而本研究为CPA，其病程较IPA长，GM在人体感染曲霉菌早期便可进入血液，但随着病程发展逐渐被血液循环所清除而逐步下降，有研究发现IPA患者体内血GM水平在8周以上逐步下降，而CPA患者的病程至少3个月以上，因此血GM水平并不能客观反映CPA患者体内的GM载量，另外由于CPA感染的部位是肺部，稍不同于侵袭性肺曲霉病(IPA)，因此，于感染部位行BALF检测，其GM值敏感度理论上要高于血清。

BALF比血清更早检测到GM升高，可能提示其更早收到真菌菌丝的侵入，载量在肺部比在其他部位更高，最近国内外的一些研究[10-12]表明，BALF-GM诊断曲霉病的灵敏度及特异度高达75.68%及80.73%，而本研究中病例组的BALF-GM结果明显高于对照组，且敏感度及特异性高达86.67%及93.75%，较部分研究者更高。 (ESCMID 2015)指南已将BALF-GM诊断CPA的推荐级别列为BII，可见它的临床价值越来越得到重视。在本研究中，以BALF-GM 为0.9作为诊断界值来诊断CPA，其与“金标准”的病理诊断符合率高达86.67%。可见BALF-GM检测结果与病理金标准有较好的一致性。同时我们也要看到，其研究仍有一定空间，如采用的阈值及采集标本的标准流程目前业界尚未有统一共识。

在诊断界值方面，目前国内外仍未有统一的标准，美国FDA将BALF-GM的诊断界值定为≥0.5[13]，而许多欧洲国家则建议定为≥1.0[14]，且需要连续两次阳性则提示GM试验阳性。本研究发现，以0.9为诊断界值时，BALF-GM对诊断CPA的灵敏度及特异度均在80%以上，从(表3)的结果可以看出，其与对照组的差异有统计学意义，这与Nguyen[15-16]等的研究结果类似。国内有学者通过Meta分析BALF-GM检测IPA的最佳临界值为1.0，因此有学者[17]建议将曲霉菌感染诊断的界值提高至1.0，避免过度诊断。但是否一样适用于CPA，仍需进一步研究证实。本研究通过设定不同的BALF-GM的诊断界值，描绘ROC曲线(图1)得出BALF-GM诊断CPA的最佳界值为0.765。当然，BALF-GM在不同人群的诊断界值可能有所不同，提示可能需要根据不同免疫功能及基础疾病，设定不同的诊断界值，这可能需要更大样本及更深入的研究，这也是我们继续深入研究的方向。

我们在研究中发现部分患者的BALF-GM结果在首次诊断时并不明显升高，但治疗的次月或第三月却异常升高，这可能与我们的镜下灌洗操作及镜下治疗有关，这些患者多存在近端气道狭窄需要行球囊扩张术治疗，因此首次灌洗标本并不能直接进入病灶空洞内，导致结果偏低，而经过球囊扩张术后进入空洞内灌洗后的标本结果则明显升高，这是与采集标本的部位有关，也一定程度上可能导致了假阴性的结果。另外抗真菌药物的使用(包括预防性抗真菌治疗)会影响血清GM值的结果，甚至造成假阴性，这可能与抗真菌使用后对曲霉菌的抑制作用，使其释放减少，但抗真菌治疗对CPA患者的BALF-GM影响鲜有人报道。本研究通过追踪病例组治疗前，治疗第1、3月的BALF-GM，发现BALF-GM结果随着治疗的深入及病情的好转呈进行性下降，但也有7名患者的BALF-GM的水平不降反升，且均在正常阈值以上，追踪这些患者的临床资料，发现其镜下治疗难度较大，治疗次数较多，使得患者的治疗时间及治疗费用均增加，且预后不良。这也给我们启发了其是否可作为评价CPA预后的标志物之一，对于需要进行腔内治疗的患者，多次的支气管镜检查及肺泡灌洗或许可收益，但对于某些CPA的某些亚型(如曲霉结节AN、亚急性侵袭性曲霉病SAIA)，多次的支气管肺泡灌洗则需要考虑伦理以及风险问题。

以上研究结果表明，通过BALF检测及动态观察GM有助于CPA的早期诊断及疗效评估，如果能联合影像学、组织病理学、血清GM，曲霉IgG抗体，曲霉荧光定量检测DNA等手段，将大大提高CPA诊断效率，这也是我们未来研究的方向。

当然，本研究也存在少许不足，如未能将CPA患者再具体分类型进行统计分析，另外国内外尚未对BALF-GM操作的标准化流程有统一共识，其结果易受生理盐水灌注量、灌注区域，回收率等影响，本研究按照中华医学会呼吸病分会的专家共识进行BAL操作，但考虑到个体差异，病情轻重，每个病人的灌注量，回收率均存在差异，对最终结果也存在一定影响，以上这些均需进一步做大样本、对照研究来避免偏倚。