高效液相色谱-串联质谱法测定睫毛增长液化妆品中的比马前列素

2020-08-03彭兴盛

分析测试学报 2020年7期

潘晨，许勇，韩晶，彭兴盛，郑荣

(上海市食品药品检验所，国家药监局化妆品监测评价重点实验室，上海 201203)

比马前列素(Bimatoprost)属于前列腺素类似物(结构式见图1)，是用于治疗青光眼和高眼压的降眼压处方药比马前列素液滴眼液(商品名Lumigan)的有效成分[1-2]，由美国Allergan公司研制，该公司先后获准上市了0.03%和0.01%的比马前列素液滴眼液。临床试验发现，比马前列素具有引起睫毛增长的副作用[3]。于是，Allergan公司于2008年底推出用于治疗眼睫毛稀少症(Eyelash hypotrichosis)[4]的Latisse(含0.03%比马前列素眼科溶液)，该药是首个也是唯一一个获得FDA许可用于睫毛增长、增粗、增黑的药物，归入处方药物管理。目前，Allergan公司拥有比马前列素药物用于刺激睫毛生长的全球独家专利。但比马前列素除了会刺激睫毛生长外，还会对眼部产生副作用，如刺激皮肤内黑色素细胞的生长，眼周黑色素沉积，眼睑发痒发肿，眼睛疼痛、结膜充血等，长期过量使用会造成视神经损伤，导致视力下降甚至失明[5-7]。

近年来，某些化妆品厂商为提高市场竞争力，利用比马前列素刺激睫毛生长的副作用，在睫毛增长液类化妆品中违规添加该成分，使得消费者在获得睫毛增长效果的同时也饱受其带来的如眼睛刺激、瘙痒、黑眼圈、结膜充血等伤害。目前，我国《化妆品安全技术规范》(2015年版)[8]的禁限用组分列表中未提及比马前列素，国外如欧盟化妆品法规(EC)NO 1223/2009[9]附件Ⅱ(禁用物质)和附件Ⅲ(限用物质)中也未作相关规定。但比马前列素作为药理活性成分，附带可预见性的危害，不应添加在化妆品中。值得注意的是，欧盟已重视并在近几年多次通报并召回含比马前列素的睫毛增长液，其中也有来自中国的产品，然而我国对于睫毛增长液化妆品中比马前列素的监管目前仍是空白。因此，为规范化妆品市场秩序，确保化妆品质量安全，保障消费者使用安全，建立睫毛增长液化妆品中比马前列素含量的检测方法已迫在眉睫。

图1 比马前列素的分子结构式Fig.1 Molecular structure of bimatoprost

目前，比马前列素的报道主要集中于药品、生物制品等领域，分析方法主要为高效液相色谱法[10-12]和液相色谱-质谱联用法[13-14]。化妆品中比马前列素的检测方法仅有几篇外文文献报道，如Johansson等[15]曾报道了利用液相色谱-四极杆飞行时间质谱(LC-QTOF-MS)和核磁共振(NMR)技术对非药用产品中未知活性成分的通用筛查方法，其中包含睫毛增长液中前列腺素类似物的筛查，但未作定量分析；Wittenberg等[16]采用液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)法测定化妆品中的前列腺素类似物，基于QuEChERS液-液萃取法处理样品，并采用氘代内标定量，该方法前处理程序相对繁琐，氘代内标成本高，也较难获得。为尽快监测国内化妆品市场中比马前列素的使用情况，本文通过简单、快速的溶剂提取，建立了一种科学、高效的睫毛生长液中比马前列素的HPLC-MS/MS测定方法，填补了我国化妆品中比马前列素测定的空白，为加快化妆品行业的质量监管和补充完善相关检验方法提供技术支持。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Agilent 1290 UPLC/6495 MS/MS液相色谱-三重四极杆串联质谱仪(美国Agilent公司)；Sartorius CP224S和225D-1CN电子天平(德国赛多利斯公司)；5800型超声仪(美国Branson公司)；MS3涡旋混合器(德国IKA公司)；5810R型台式离心机(德国Eppendof公司)；Milli-Q Reference A+型超纯水仪(美国Millipore公司)。

比马前列素标准品(纯度99%，上海源叶生物科技有限公司)；乙腈、甲醇(色谱纯，德国默克公司)；甲酸、乙酸铵(色谱纯，德国Sigma公司)。

1.2 标准溶液配制

标准中间溶液：精密称取比马前列素标准品10 mg，用甲醇溶解并定容至100 mL棕色容量瓶中，摇匀，配成质量浓度为100 μg·mL-1的标准储备液，于-18 ℃避光保存。精密吸取上述标准储备液1 mL，用甲醇稀释定容至100 mL棕色容量瓶中，配成质量浓度为1.0 μg·mL-1的标准中间溶液。

标准工作溶液：精密吸取适量标准中间溶液，用50%(体积分数)甲醇溶液稀释制得质量浓度分别为0.5、1、5、10、20、50、100 ng·mL-1的系列标准工作溶液。

1.3 样品前处理

精确称取试样0.2 g(准确至0.001 g)至50 mL聚丙烯离心管中，加入20 mL 50%甲醇溶液涡旋3 min，充分混匀，以10 000 r·min-1离心10 min，取上清液适量经0.22 μm微孔滤膜过滤后，待测，同步进行空白试验。

1.4 色谱-质谱条件

色谱条件：色谱柱为Agilent Poroshell 120 EC-C18柱(4.6 mm×100 mm×2.7 μm)；流动相：5 mmol·L-1乙酸铵(含0.02%甲酸)(A)-乙腈(B)(体积比55∶45)，等度洗脱；柱温30 ℃；流速0.3 mL·min-1；进样量5 μL。

质谱条件：电喷雾离子源，正离子电离模式(ESI+)；毛细管电压：3 500 V；干燥气温度：250 ℃；干燥气流速：14 L·min-1；雾化器压力：1.378 bar；鞘气温度：250 ℃；鞘气流速：11 L·min-1；裂解电压：380 V；检测方式：多反应监测(MRM)模式。

2 结果与讨论

2.1 液相色谱条件优化

考察了水-乙腈、乙酸铵-乙腈、甲酸/乙酸铵-乙腈3种流动相体系对比马前列素的色谱行为和离子化程度的影响。结果显示，以水-乙腈为流动相时待测物峰形有拖尾现象，在加入5 mmol·L-1乙酸铵后得以改善。另外，向流动相中添加一定量甲酸可提高比马前列素的离子化效率，因此实验考察了水相中添加不同体积分数(0.01%、0.02%、0.05%、0.1%)甲酸对测定的影响。结果显示，甲酸含量为0.02%时待测物的响应最高。通过优化，最终确定采用含0.02%甲酸的5 mmol·L-1乙酸铵水溶液-乙腈(体积比55∶45)为流动相等度洗脱，此时比马前列素可在5 min内获得良好的峰形和响应，其总离子流图见图2。

图2 比马前列素标准溶液的总离子流图(50 ng·mL-1)Fig.2 Total ion chromatogram of bimatoprost(50 ng·mL-1)

2.2 质谱条件优化

以1.0 μg·mL-1比马前列素标准溶液进行质谱条件优化，在正模式下全扫描。结果显示，[M+H]+峰响应非常低，[M+Na]+丰度最高，为抑制加钠峰的出现尝试向流动相中添加一定量乙酸铵，但并无明显改善[16]。文献报道对比APCI源和ESI源测定马前列素的结果，发现APCI源虽可在一定程度上减少[M+Na]+，但整体灵敏度比ESI低[16]。由于[M+Na]+峰容易受分析环境影响而不稳定，在定量分析时应尽量避免使用。另外，进行全扫描时还发现存在丰度较高的[M+H-H2O]+、[M+H-2H2O]+、[M+H-3H2O]+峰，这可能是因为比马前列素为多羟基化合物，电离时容易脱水得到系列[M+H-nH2O]+峰，因此最终采用响应高且稳定的[M+H-H2O]+(m/z398.2)为母离子，再利用二级质谱扫描确定其子离子，选择响应好且稳定的2个子离子(m/z362.2、317.1)组建MRM离子对，并优化确定其它质谱参数(表1)。

表1 比马前列素的质谱参数Table 1 MS parameters of bimatoprost

2.3 前处理条件优化

比马前列素在甲醇、乙腈等有机溶剂中均具有较好的溶解度，考虑到乙腈毒性大且成本高，故选择甲醇为的提取剂。由于市售睫毛增长液为水溶液状态，加入溶剂涡旋即可充分混匀，为简化操作步骤，比较了不同甲醇含量(100%、80%、50%、30%)超声(10 min)和涡旋(3 min)的提取效率。结果显示，以100%甲醇提取时比马前列素的峰形前展，其余3种比例甲醇提取后的峰形对称，回收率均高于90%，且以50%甲醇的提取效率最高，故选择50%甲醇为提取溶剂。通过实验比较显示，超声10 min和涡旋3 min的提取效率无明显差异，为节约时间成本，故选择涡旋3 min进行提取。而对一些不能很好分散或溶解的样品，可进行超声处理。

由于化妆品基质中含有大量表面活性剂和脂溶性物质，实验考察了Captiva EMR-Lip脂质净化柱对样品的净化效果。结果发现，在空白基质样品中添加5.0 μg·g-1比马前列素，经Captiva EMR-Lip脂质净化柱重力自洗脱后的回收率低于50%，表明Captiva EMR-Lip净化柱不适用于目标物净化，故前处理过程不采用脂质净化柱净化。

2.4 基质效应的考察

基质效应会影响方法的准确度和精密度，通常采用提取后添加法评价[17-18]，同时考虑到基质效应的增强或抑制程度一般随分析物浓度的不同而发生改变，因此本研究采用基质匹配标准曲线的斜率与溶剂配制标准曲线的斜率之比来考察基质效应，若比值小于1，则为基质抑制效应，反之为基质增强效应。结果发现，3个样品组(质量浓度均为0.5、1.0、5.0、10、20、50 ng·mL-1)的斜率比值为0.92、0.94、0.92，表明该方法存在一定程度的基质抑制效应，采用基质匹配标准曲线定量可较好地消除基质效应的影响，提高结果准确性。

2.5 线性关系、检出限及定量下限

选用不含比马前列素的空白样品，按照“1.3”方法进行样品前处理，取滤液作为稀释液，配制比马前列素质量浓度分别为0.5、1.0、5.0、10、20、50、100 ng·mL-1的系列标准溶液，分别进样5 μL，以比马前列素的定量离子对峰面积为纵坐标(y)，对应质量浓度为横坐标(x，ng·mL-1)进行线性回归。结果显示，比马前列素在0.5～100 ng·mL-1质量浓度范围内线性良好，线性方程为y=1 706.4x-7.559 6，相关系数(r2)为0.998 2。以3倍信噪比(S/N=3)和S/N=10计算得检出限(LOD)和定量下限(LOQ)分别为0.015、0.05 μg·g-1，可满足分析要求。

2.6 回收率与相对标准偏差

取空白样品0.2 g，分别加入一定量比马前列素标准溶液，配成低(0.05 μg·g-1)、中(0.5 μg·g-1)和高(5.0 μg·g-1)3个水平的加标溶液，在优化条件下，每个浓度平行测定6次，计算回收率和相对标准偏差(RSD)。结果显示，3个加标浓度下比马前列素的平均回收率分别为98.6%、101%、99.2%，RSD(n=6)分别为2.4%、2.1%、1.2%，表明该方法的准确度和精密度良好，可满足检测要求。