智能手机微孔板分析仪的开发与HSA的定量检测

晁晓欣，李海琴，杨泽华，张校亮，谭 慷，李晓春*

(1.太原理工大学 新型传感器与智能控制教育部与山西省重点实验室 物理与光电工程学院，山西 太原 030024；2.太原理工大学 生物医学工程学院，山西 太原 030024；3.山西医科大学第六医院，山西 太原 030008)

人血清白蛋白(Human serum albumin,HSA)是由肝实质细胞合成的一种蛋白质，人体血液包含的蛋白质中HSA的含量最多，所占比例约为40%～60%。HSA对于确保血浆渗透压维持在稳定值，调节体腔间液体分布具有重要作用，是临床血常规检测的重要指标之一，正常人体血液中HSA的浓度值为35～ 55 g/L，其浓度水平的增高或降低可以预示多种疾病[1-2]。目前HSA的检测方法主要有盐析法、电泳法和比色法[3]，相比其它检测方法，比色法具有反应快速、操作简便和检测准确的优点。溴甲酚绿比色法通过建立反应溶液的色度信息与HSA浓度值的关系实现HSA的定量检测，是临床检测HSA的常用方法。

智能手机具有普及范围广、轻量便携、高分辨率成像和强大的数据处理功能等优点，且可以远程传输实现数据的实时共享[4]，其内置有多种传感器可以实现生化指标的即时检测[5-6]。手机摄像头是最常用的一种传感器，可进行样品的数字图片采集并实现比色分析检测。近几年，研究人员开发了许多基于智能手机的检测设备，并将其用于医学指标[7-9]和其它生化分子检测[10-11]。相比目前实验室中使用的大型检测仪器，利用智能手机开发的便携式、低成本的检测设备可以面向普通用户，在现场快速检测领域具有巨大潜力。微孔板是一种高通量反应容器，利用它可以提高检测速度并降低检测成本，有利于疾病的快速诊断并降低检测费用。目前微孔板的分析主要依赖于酶标仪，而酶标仪是一种光谱分析仪器，内部包含精密的光学元件和复杂的光路设计，其体积大、价格昂贵、操作复杂且依赖于电脑，难以应用到现场快速检测中。基于此，将智能手机和微孔板结合起来开发新的便携式检测仪器引起了研究人员的广泛关注。但是实验中存在一个问题，即手机摄像头无法对尺寸很大的96微孔板全范围准确成像，研究者提出了很多方法来解决这个问题。2015年，Berg等[12]提出使用96根光纤采集微孔板的图像，再将获得的图像用手机摄像头进行拍照和自动分析处理的方法。这种方法使用光纤对大尺寸的微孔板进行图像采集，再将光纤采集的小尺寸图像用手机进行拍照，解决了手机摄像头不能对微孔板全范围准确成像的问题。2016年，Wang等[13]设计制作了一个由64个小的微棱镜构成的微棱镜阵列，将微棱镜阵列放置在微孔板上方使每一个微孔都正对一个微棱镜，由于从微孔板中透射的光线会在微棱镜中发生折射，并且微棱镜的斜三角形设计会让光线偏折进手机摄像头中，从而实现了智能手机对微孔板中64个微孔的准确成像分析。2018年，Wang等[14]成功地将之前的微棱镜扩展为96个微棱镜，实现了96个微孔的准确成像分析。使用微棱镜的方法改变了光路的方向，使微孔板中的光线偏折会聚到手机摄像头中，实现了智能手机对微孔板全范围准确成像。随后，Yang等[15]尝试利用反射镜将微孔板底部的图像反射到手机摄像头中实现智能手机对96微孔板的全范围准确成像，该方法将之前手机摄像头从微孔板上方成像变为对微孔板底部成像，解决了手机对微孔板拍照时，液面反射光对实验的影响，但该方法无法解决智能手机对微孔板全范围准确成像的问题。综上所述，使用光纤和微棱镜的方法可以解决全范围成像的问题，但是光纤采集图像和微棱镜的制作工艺都非常复杂且成本很高，无法广泛应用于资源有限和不发达地区。2019年，李伟等[16]提出直接利用手机摄像头对微孔板中的反应溶液进行拍照，利用计算机对获得的图像进行自动分析处理，然后再将检测结果显示在手机界面上的方法。文中开发的检测系统在手机距离微孔板180 mm时才能对32个微孔进行准确成像，要实现手机摄像头对尺寸很大的96微孔板全范围准确成像，就必须增加手机到微孔板的距离，但这会增加检测装置的体积并且降低成像的分辨率，难以应用到现场快速检测中。

为了更好地解决这个问题，本文采用大孔径的聚焦透镜对光线进行折射会聚，以实现智能手机对96微孔板的全范围准确成像。通过设计面光源为微孔板提供均匀照明，以3D打印技术制作光学装置，并结合智能手机应用程序开发了一款便携式微孔板分析仪。采用开发的分析仪实现了病人血清样品中HSA的快速定量检测，且检测结果与生化分析仪检测结果一致，可以满足临床检测的需求。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

TKA-Genpure UV 超纯水系统(美国赛默飞世尔公司)；Starter 3100 pH计(美国奥豪斯公司)；MB100-4A微孔板恒温振荡器(杭州奥盛仪器有限公司)；Pipet-Lite XLS多通道移液枪(美国梅特勒托利多公司)；Multiskan FC酶标仪(赛默飞世尔(上海)仪器有限公司)。

溴甲酚绿(变色范围3.8～5.4，Bio Basic Inc公司)；人血清白蛋白(HSA，96%～99%)、叠氮钠(分析纯，≥99.5%)购自索莱宝公司；氢氧化钠(≥98.0%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；柠檬酸(≥99.5%，科密欧公司)；柠檬酸钠(分析纯，≥99%)、Tween-20购自美国Sigma-Aldrich公司；人血清白蛋白标准物质(国家标准物质中心)；人血清实际样品来自山西医科大学第六医院；实际样品浓度值由日立全自动生化分析仪7600P测得。

1.2 溴甲酚绿显色剂的制备

柠檬酸缓冲液(pH 4.2)：将0.1 mol/L的柠檬酸和0.1 mol/L的柠檬酸钠按照12.3∶7.7的体积比混合，配成pH 4.2的缓冲液。

溴甲酚绿显色剂：向419 mg的溴甲酚绿中加入10 mL 0.1 mol/L的NaOH溶液和100 mg的NaN3，用柠檬酸缓冲液定容至1 000 mL，随后在每1 mL溶液中加入2.5 μL Tween-20，溶液由蓝绿色变为黄绿色，即制得溴甲酚绿显色剂。

1.3 白蛋白标准样品的制备

人血清白蛋白标准物质溶液中白蛋白的质量浓度为42.9 g/L，取50 μL HSA标准物质加入2.6 mg白蛋白粉末配成85.8 g/L的白蛋白溶液。用柠檬酸缓冲液稀释白蛋白溶液，制备成质量浓度分别为60.06、55.77、51.48、47.19、42.90、38.61、34.32、30.03、25.74、21.45 g/L的10个白蛋白标准样品。

1.4 智能手机微孔板分析仪的开发

1.4.1 智能手机的光学装置为了给微孔板提供均匀的照明并避免周围环境光的影响，设计了一个可以与智能手机结合使用的光学装置。该光学装置的示意图如图1A所示，整个装置尺寸为144 mm×144 mm×135 mm。图1B为光学装置的内部结构，主要由面光源、微孔板插槽、透镜和智能手机拍照口组成，装置各部分固定封闭在外壳里，透镜固定在微孔板的正上方，外壳上面有一个拍照孔，手机通过拍照孔对微孔板进行拍照成像。整个装置采用3D MAX Studio设计，并使用3D打印机(惠普)打印。面光源放置在微孔板的下方，光从微孔板透射出来后进入透镜中，经透镜的折射会聚到手机摄像头中。实验中使用220 V交流电为面光源供电，使用华为Honor7i智能手机进行拍照和数据分析。图1C所示为智能手机应用程序测定HSA的实际过程以及待放入的微孔板。

图1 基于智能手机微孔板分析仪的光学装置示意图(A)、内部结构图(B)以及智能手机测定HSA实际操作过程(C)Fig.1 Schematic diagram(A),internal structure(B) of optical device on smartphone-based microplate reader and the operation for measuring HSA concentration using a smartphone(C)

1.4.2 智能手机应用程序检测原理及过程本文设计的智能手机应用程序在华为Honor7i手机上进行调试，此程序也可以安装在其它Android操作系统的手机上。图2为应用程序“HSA Detect”运行界面。用户点击手机桌面上的应用程序图标后，程序开始运行并进入主界面(图2A)，主界面有3个选项：“Detect”、“Help”和“Quit”。当用户点击界面上的“Detect”按钮后，程序进入检测界面(图2B)，屏幕上显示96微孔板矩形预览框，使每个矩形预览框与微孔板的微孔对齐，自动聚焦后点击拍照图标按钮，此时应用程序自动调用智能手机的相机拍摄照片，同时在后台自动处理图片和分析数据。最后，用户点击“Analyze”按钮，样品的色度信息以及检测结果将显示在结果界面(图2C)。应用程序分析处理的过程首先是将获得的图片裁剪，计算各微孔中心区域25×25 pixel像素区域的平均像素强度并将其转换为RGB值，然后根据标准样品的RGB值和浓度值之间的关系自动拟合标准曲线，最后将待测样品的RGB值代入标准曲线得到对应的浓度值，并将检测结果显示在智能手机屏幕上。

图2 智能手机检测HSA的手机界面Fig.2 Smartphone app interface of HSA detectionA.main menu; B.detection interface; C.results interface

2 结果与讨论

2.1 智能手机微孔板分析仪成像效果分析

智能手机摄像头对96微孔板进行成像时，正对手机摄像头的微孔可以准确成像，而边缘的微孔由于手机摄像头视场有限，导致部分孔底光线无法进入摄像头中，从而无法对其准确成像。智能手机微孔板分析仪中手机摄像头的位置是固定的，但是每个微孔到手机摄像头的角度和位置都不同，因此，手机摄像头对96个微孔所成的像均不一样，导致96个微孔的背景颜色不一致，无法实现待测样品的准确比色分析。为解决该问题，采用对光线具有折射会聚作用的透镜，使从微孔板中透射出来的光线经过透镜折射后会聚到手机摄像头中，实现对96微孔板中所有微孔的准确成像。

为了对使用透镜前后智能手机的成像效果进行分析，在微孔板的所有微孔中加入浓度、体积均相同的品红色墨水，然后用智能手机进行拍照。图3A是手机直接对微孔板拍照获得的图片，从图中可以看出边缘微孔的孔底无法准确成像，拍照时会拍到孔底边缘，在对获得的图片进行颜色分析时，孔底边缘会对样品的色度信息产生影响，从而影响样品检测的准确性。图3B是使用透镜后智能手机对微孔板拍照获得的图片，从图中可以看出所有微孔均可准确成像，且所成的像和手机摄像头正对微孔拍照时的成像一致，可以看到完整的孔底。使用透镜后智能手机摄像头获得的微孔板图片中，微孔的背景颜色是孔底的颜色，且所有样品孔的背景颜色一致，可以满足数字图片比色分析的要求。

图3 智能手机直接对微孔板拍照所获得的图像(A)以及放置透镜后获得的图像(B)Fig.3 The image of a microplate directly captured by the smartphone(A) and the captured image of a microplate with a lens(B)

2.2 Tween-20含量的优化

Tween-20是一种常用的去离子表面活性剂，参与溴甲酚绿显色反应时可使反应溶液由暗绿色变成桔黄色，降低其在630 nm处的空白吸光度值。为了降低实验中反应溶液的空白背景，提高检测的灵敏度和检测范围，需要确定Tween-20的最佳浓度。实验中，用紫外可见分光光度计测定Tween-20含量为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 μL/mL的溴甲酚绿溶液的吸光度值。结果如图4所示，从图中可以看出，随着Tween-20含量的增加，溶液630 nm处的吸光度值逐渐下降，当Tween-20含量为2.5 μL/mL时，630 nm处的吸光度达到饱和，并且溶液的颜色由蓝绿色变成桔黄色。为了保证溴甲酚绿显色剂的空白吸光度值最小，且Tween-20试剂不过量，确定实验中Tween-20的最佳含量为2.5 μL/mL。

图4 溴甲酚绿溶液630 nm处的吸光度和Tween-20含量的关系Fig.4 Relationship between the absorbance at 630 nm of bromocresol green solution and Tween-20 content

2.3 颜色通道的选择

智能手机数字图片比色分析通过分析R、G、B值与浓度值之间的关系实现浓度测定，在不同实验中，R、G、B 3个颜色通道对待测样品的响应变化不同，因此，选择合适的颜色通道对保证检测结果的准确性具有重要意义。为了确定本仪器测定HSA溶液的最佳颜色通道，用开发的分析仪对HSA标准样品进行拍照分析。在HSA检测实验中，随着HSA浓度增加,溶液的颜色由黄绿色变为蓝绿色，测定10个不同质量浓度的人血清白蛋白标准样品，并将显色完成后的溶液用智能手机拍照，计算所获图片中检测区域的R、G、B值，并分析颜色值与质量浓度之间的关系。如图5所示，R值和G值随着HSA质量浓度的增加均表现出很宽的变化范围，并且与质量浓度之间呈线性关系，相关系数分别是0.982 2和0.993 0，而B值没有明显的线性变化。此外，G值的线性相关度相比R值的更高，表明在HSA实验中G值更敏感。因此，用开发的分析仪测定HSA浓度时，颜色通道选择G通道。

图5 RGB值随HSA质量浓度的变化Fig.5 Variation of RGB value with HSA mass concentrationA.R value;B.G value; C.B value

2.4 基于智能手机微孔板分析仪检测HSA

为了探究智能手机微孔板分析仪的准确性和可靠性，用开发的分析仪和商用酶标仪同时测定相同的样品，并进行对比。配制不同质量浓度(21.45 ～60.06 g/L)的HSA标准样品，将智能手机测得的反应溶液G值与酶标仪测得的吸光度进行比较。如图6A所示，从图中可以看出，两种仪器的测定结果之间呈现良好的线性相关性，相关系数为0.989 3，证明开发的分析仪可以准确检测样品中HSA浓度。此外，正常人体中白蛋白的质量浓度范围为35 ～55 g/L，因此实验中确立的标准曲线可以满足实际检测的需求。

图6 酶标仪和智能手机检测结果的相关性(A)以及实际样品中生化分析仪检测结果和智能手机检测结果的比较(B)Fig.6 Correlation of the measurement result between microplate reader and smartphone(A) and comparison of smartphone and the clinical analyzer in the detection of human serum samples(B)

为了进一步验证所开发智能手机微孔板分析仪的实用性，采用开发的仪器测定12个病人血清样品中的HSA浓度值，并将检测结果与医院全自动生化分析仪测定的结果进行比较。全自动生化分析仪的测定方法和本文方法均为溴甲酚绿法，两种仪器的测定结果如图6B所示，从图中可以看出两者的检测结果呈现良好的一致性，从而验证了本文设计开发的分析仪可以满足临床检测的需求，同时，相比目前使用的全自动生化分析仪，所开发的检测仪具有体积小、成本低廉和操作简单的优点。

3 结 论

研究开发了基于智能手机的便携式96微孔板检测技术与仪器，并利用开发的仪器实现了HSA的高通量快速定量检测。首次采用大孔径聚焦透镜实现了手机对微孔板的全范围准确成像，设计了面光源为微孔板提供均匀照明，通过3D打印制作了光学装置，结合开发的应用程序实现了对96微孔板中所有样品的自动分析。利用该检测仪器对HSA标准样品进行测定，检测结果与酶标仪检测结果具有高度的线性关系，证明开发的分析仪具有良好的准确性和可靠性。用该仪器实现了病人血清样品中HSA的定量检测，检测结果和医院的全自动生化分析仪测定结果具有良好的一致性，可以满足临床中HSA的检测需求。该分析仪具有体积小和成本低的优点，可广泛应用于经济不发达地区、基层医疗机构和普通用户家中，实现HSA的现场快速定量检测。