基于超高效液相色谱-离子阱-飞行时间质谱联用的白血病细胞及耐药细胞非靶标代谢组学研究
2020-08-03周玲婳卢红梅
周玲婳,卢红梅
(中南大学 化学化工学院,湖南 长沙 410083)
白血病是一种因造血干细胞在分化过程中不同阶段发生凋亡障碍、分化阻滞以及恶性增殖而引起的异质性造血系统恶性肿瘤。根据临床和病理情况,一般将白血病分为慢性淋巴细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性髓系细胞白血病、急性髓系细胞白血病和其它少见的白血病类型。白血病的主要治疗方式为多种药物结合化疗和骨髓移植,而多药耐药性是治疗中的最大障碍之一。白血病多药耐药性的形成机制十分复杂,目前许多报道从相关基因[1-3]、蛋白质[4-5]和代谢物[6-8]等多方面进行研究。其中,代谢组学作为一门致力于研究整个生物体的动态代谢状态的“组学”,具有以下优点:①所需检测的代谢产物数量远少于基因和蛋白质的数量;②基因和蛋白水平的微小改变会在代谢产物中被放大;③检测对象是代谢的最终产物,能够直接反映机体的生理或病理状态[9-10]。这些优点使得代谢组学广泛用于各种疾病的代谢研究。
目前,液相色谱-质谱联用(LC-MS)因具有灵敏度高、分辨率高、稳定性好、干扰小等优点,而成为细胞代谢物研究的最热门分析手段之一。由于细胞中各种酶反应活跃且繁多,代谢产物成分复杂,浓度跨度大,物质之间理化性质差异较大,所以最大限度地提取细胞内代谢物是非靶标分析方法的关键步骤。细胞猝灭是进行细胞内代谢物分析前的最重要步骤,Dietmair等[11]比较了60%甲醇、含0.9%碳酸氢铵(AMBIC)的60%甲醇和0.9% NaCl溶液3种常用的猝灭溶剂,发现0.9%的NaCl溶液对哺乳动物细胞有较好的猝灭效果,并通过比较12种溶剂体系对中国仓鼠卵巢(CHO)细胞的提取结果,发现50%乙腈水溶液的效果最好。He等[12]基于气相色谱-质谱联用比较了100%甲醇、甲醇/甲醇/水(2∶2∶1,体积比)、50%乙腈水溶液和60%甲醇水溶液4种提取溶剂的提取效率,发现甲醇/甲醇/水的提取效果最好。Liu等[13]发现80%甲醇对人结肠腺癌(HCT8)细胞的代谢物提取最多。所以,对不同类型的细胞分析时,应优化出最合适的溶剂提取方法。除了溶剂提取外,利用物理化学或机械作用力,如超声、冻融、微波[14]等方法进行细胞破碎,可帮助提高胞内代谢物的提取效率。
本实验采用超高效液相色谱-离子阱-飞行时间质谱(UPLC-IT-TOF MS)联用分析平台,以人慢性髓系白血病细胞及其阿霉素耐药细胞(K562和K562-ADM)制备成的质量控制(QC)样本为研究对象,以获得的代谢特征峰数目和方法重复性等为评价指标,分别考察了细胞破碎方法、提取溶剂体系以及溶剂体积对提取效果的影响,以期建立可靠的研究2种细胞代谢物差异的非靶标代谢组学分析方法。
1 实验部分
1.1 仪器与试剂
液相色谱-质谱联用仪:LC-30AD超高效液相色谱系统、Shimadzu LCMS-8050离子阱-飞行时间质谱仪(Shimadzu公司);高速台式冷冻离心机(湖南湘仪科学仪器有限公司);KQ3200B超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);HSC-24A氮吹仪(南京科捷分析仪器有限公司);AL104电子分析天平(Mettler-Toledo公司);加热/制冷型-TCS10恒温混匀仪(杭州瑞城仪器有限公司);IKA MS 3digital涡旋仪(北京联合科仪科技有限公司)。
甲酸、甲醇、乙腈和异丙醇(HPLC级,德国Merck公司);纯净水(杭州娃哈哈公司);氯仿(优级纯,科隆化工试剂厂);甲基叔丁基醚(优级纯,上海泰坦科技股份有限公司);胎牛血清(以色列Biological Industries);RPMI 1640培养基(美国Hyclone公司)。标准品:L-苯丙氨酸、L-色氨酸、L-甲硫氨酸、L-亮氨酸、L-精氨酸、L-肉碱和马尿酸均购于美国Sigma公司。
1.2 细胞的培养与收集
人慢性髓系白血病细胞(K562细胞株)及其阿霉素耐药细胞(K562-ADM耐药细胞株)均来自中南大学湘雅医学院。
K562和K562-ADM细胞常规培养于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基(37 ℃,5%CO2)中。K562-ADM细胞培养于含阿霉素(300 ng/mL)的培养基中直至细胞收集前1周。
当细胞处于指数生长期时,用血细胞计数器计算培养基中细胞的密度,从而计算收集每个样本所需的细胞悬浮液体积(V1)。采用液氮和5V1的9 g/L NaCl(4 ℃)溶液进行猝灭。
1.3 样本预处理
将K562和K562-ADM细胞等量混合后,等分为200个QC样本(每个QC样本中细胞数量为2×106)。以QC样本进行细胞破碎方法、提取溶剂体系和提取溶剂体积的条件考察后,得到优化的样本预处理步骤如下:
向QC样本中加入10 μL的马尿酸(5.34 μg/mL,内标)和400 μL的80%甲醇(-20 ℃预冷),涡旋1 min后,置于超声清洗仪中超声7.5 min,通过加冰维持水温为4 ℃。在4 ℃下16 000 r/min离心10 min后,将上层代谢物提取液转移至置于干冰上的玻璃离心管中。剩余物质再用400 μL的80%甲醇(-20 ℃预冷)重复上述步骤,收集代谢物提取液,氮吹至完全干燥,复溶于100 μL 80%甲醇(5%甲酸,体积分数,下同)中,离心10 min(16 000 r/min,4 ℃),取上层清液于进样瓶中,进样分析。
1.4 仪器条件
液相色谱条件:ACQUITY UPLC HSS C18色谱柱(2.1 mm×100 mm,1.8 μm,Waters 公司),柱温为35 ℃,自动进样器温度为4 ℃,进样量为4 μL。流动相:A相为含0.1%甲酸的水溶液,B相为含0.1%甲酸的乙腈溶液。梯度洗脱条件:0~3 min,5% B;3~4.5 min,5%~50% B;4.5~15 min,50%~100% B;15~25 min,100% B。流速在0~19 min时为0.30 mL/min;19~20 min,0.30~0.35 mL/min;20~25 min,0.35 mL/min。
质谱条件:电喷雾离子源正离子模式,CDL管的温度为200 ℃,雾化气(N2)流速为1.5 L/min,干燥气(N2)压力为100 kPa,离子阱压力为1.8×10-5kPa,检测器电压为1.62 kV,喷雾电压为+4.5 kV,RP真空度为85.0~92.0 Pa,IT真空度为1.8×10-2Pa,TOF真空度为1.3×10-4Pa。前处理条件优化时采用质谱全扫描模式,扫描范围为m/z100~1 000;后续对差异代谢特征定性时进行MS/MS数据采集,扫描范围为m/z50~1 000。
1.5 数据处理与统计分析
将UPLC-MS获得的原始数据从工作站转换为MADATA格式的文件,再将文件导入MZmine 2.0软件[15]进行峰提取、同位素峰合并、峰值积分、峰对齐,生成包含保留时间、质荷比和面积的数据矩阵,按80%规则[16]去除零值,并以内标法进行校准后,数据矩阵导入MetaboAnalyst 4.0(https://www.metaboanalyst.ca/)中。对数据进行主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA),并进行双尾t检验和对p-value采用Benjamini-Hochberg方法进行错误发现率(FDR)校正,以得到的校正p值和2组数据平均值的倍数变化(FC=平均值(K562强度)/平均值(K562-ADM 强度)),确定其是否具有显著性差异。
通过代谢特征的准确质荷比以及MS/MS碎片信息,结合仪器工作站的Formula Predictor软件,在METLIN(http://metlin.scripps.edu/)和HMDB(http://www.hmdb.ca/)数据库中搜索推测可能的结构式,部分代谢特征进行标准品比对鉴定。
1.6 方法学考察
仪器稳定性:按“1.3”方法处理QC样本,同一QC样本连续进样6次,计算代谢特征峰强度的相对标准偏差(RSD),考察仪器稳定性。
方法重复性:按“1.3”方法平行处理6份样本,连续进样,计算代谢特征峰强度的RSD,考察方法重复性。
日内精密度:按“1.3”方法平行处理 QC样本,分别于制备后0、2、4、6、8、10、12 h进样分析,计算代谢特征峰强度的RSD,考察日内精密度。
2 结果与讨论
2.1 样品处理方法的优化
2.1.1 细胞破碎方法的优化以甲醇为提取溶剂,考察了超声和冻融循环2种常见的细胞破碎方法对细胞代谢物提取的影响。其中冻融循环破碎方法的步骤如下:样本加入提取溶剂,涡旋1 min后,在液氮中放置10 min,然后在37 ℃的恒温混匀仪中振荡5 min,冻融步骤重复3次,离心后,转移提取代谢物至干净的玻璃离心管中,溶剂提取循环3次。超声破碎方法见“1.3”。每种方法处理6个平行样。对实验得到的2组数据进行处理,以代谢特征峰数目、相同代谢特征峰的平均强度和RSD为指标,对不同的细胞破碎方法进行评价。
结果显示,冻融循环破碎和超声破碎方法得到的代谢特征峰数目分别为(514.17±2.32)和(556.33±6.28)(图1A)。两种方法检测到330个相同的代谢特征峰(图1B),其中254个代谢特征峰具有显著性差异(p<0.05),超声破碎法有227个代谢特征峰的平均强度大于冻融循环破碎法,说明超声破碎法能检测到更多的代谢特征峰数目,并且对于共同检测到的代谢特征峰具有更高的破碎效率。
图1 2种细胞破碎方式的比较Fig.1 Comparison of two methods for cells disruptionA:results of feature number;B:Venn diagram comparison of feature numbers;C:box plot of RSD distribution
RSD常用于评价方法的重复性,在基于LC-MS的代谢组学研究中,单个代谢物最大的允许误差为20%[17]。图1A中,冻融循环破碎和超声破碎方法得到的RSD≤20%的代谢特征峰数目分别为(446.00±3.03)和(467.83±4.79)。从RSD箱线图(图1C)可见,2种方法所检测的代谢特征峰的RSD大部分小于20%,说明2种方法的重复性均良好。但超声破碎法的均值和四分位距(IQR)范围的RSD数值更小,表明超声破碎法的重复性更好,且超声破碎法耗时更短,操作更简单,所以选择超声方法进行细胞破碎。
2.1.2 细胞提取溶剂的优化比较了80%甲醇(80%MeOH)、甲醇/异丙醇/水(M/IPA/W,2∶2∶1)、甲醇/乙腈/水(M/ACN/W,2∶2∶1)、甲醇/氯仿/水(M/CHCl3/W,2∶2∶1)和甲醇/甲基叔丁基醚/水(M/MTBE/W,2∶2∶1)5种溶剂体系的提取结果。实验前,溶剂均于-20 ℃预冷,每种方法处理6个平行样。如图2A所示,5种溶剂提取得到的代谢特征峰数目分别为(628.67±11.50)、(518.83±7.83)、(503.50±8.41)、(526.00±4.60)和(539.83±12.12),其中80%甲醇提取的代谢特征峰最多。5种提取溶剂检测到203个相同的代谢特征峰,其中198个代谢特征峰具有显著性差异(p<0.05);比较相同代谢特征峰的平均强度,5种溶剂提取得到平均强度最大的代谢特征峰个数依次为66、4、7、120和1。这表明对于相同代谢特征峰,甲醇/氯仿/水的提取效果最好,其次为80%甲醇,其它3种提取效果较差。
此外,5种溶剂提取得到RSD≤20%的代谢特征峰数目分别为(511.50±10.33)、(422.00±3.83)、(439.83±7.47)、(375.00±5.71)和(380.50±10.52),其中80%甲醇得到的代谢特征峰数目最多(图2A)。从RSD箱线图(图2B)可见,5种提取溶剂的代谢特征峰的RSD大部分小于20%,表明5种提取溶剂的重复性很好,其中甲醇/乙腈/水的四分位距最小,表明RSD波动小,且四分位距范围的RSD数值和均值最小,说明该提取溶剂的重复性最好。80%甲醇和甲醇/异丙醇/水在四分位距范围的RSD数值分布和均值比前者略大,重复性次之,而甲醇/甲基叔丁基醚/水和甲醇/氯仿/水在四分位距范围的RSD数值分布最宽,均值最大,表明重复性较差。综上,80%甲醇的提取效果较好,且溶剂更安全,因此本实验选择80%甲醇为提取溶剂。
图2 5种溶剂的提取结果Fig.2 Results of five solvents for metabolites extractionA:results of feature number;B:box plot of RSD distribution
2.1.3 提取溶剂体积的优化考察了80%甲醇的体积(500、800、1 000 μL)对细胞代谢物提取效果的影响,每种方法6个平行样。结果显示,上述3种溶剂体积提取的代谢特征峰数目分别为(609.33±11.68)、(722.83±10.41)和(677.67±11.02),其中800 μL提取到的代谢特征峰最多(图3A);此外,3种体积检测到504个相同的代谢特征峰(图3B),其中40个代谢特征峰具有显著性差异(p<0.05),3组数据中平均强度最大的代谢特征峰个数依次为6、12和22,说明体积对于相同代谢特征峰的强度影响不明显。
此外,上述3种溶剂体积得到RSD≤20%的代谢特征峰数目依次为(467.33±9.71)、(610.00±8.54)和(528.00±8.89),800 μL溶剂提取的代谢特征峰数目最多(图3A)。RSD分布的箱线图(图3C)显示,3种体积提取的代谢特征峰的RSD大部分小于20%,表明3种体积提取的重复性很好,但溶剂体积为800 μL时RSD的均值最小,且在四分位距范围的RSD最小,表明800 μL提取的重复性更好,所以提取溶剂体积选择800 μL。
图3 3种溶剂体积的提取结果Fig.3 Results of three solvent volumesA:results of feature number;B:Venn diagram comparison of feature numbers;C:box plot of RSD distribution
2.2 方法学考察
按照 “1.6”方法考察了仪器稳定性、方法重复性和日内精密度。在仪器稳定性考察中,98%的代谢特征峰的RSD小于20%;在方法重复性考察中,93%的代谢特征峰的RSD小于20%;在日内精密度考察中,88%的代谢特征峰的RSD小于20%。以上结果表明,仪器稳定性和方法重复性较好,样本在12 h内较稳定,可用于细胞代谢组差异分析。
2.3 细胞的代谢物分析
按照“1.3”对K562和K562-ADM细胞(每个样本的细胞数量为2×106个)进行前处理,“1.4”条件进行分析,每隔5个样本穿插1个QC样本以监测实验过程。将所得数据导入MetaboAnalyst 4.0进行PCA分析,利用OPLS-DA模型进行差异代谢物筛选。PCA分析结果见图4A,可见QC样本聚集紧密,表明建立的实验方法稳定,可用于下一步的代谢分析。OPLS-DA模型的解释能力和预测能力参数分别为R2Y=0.940和Q2=0.932(图4B和4C),说明该模型可靠。同时,OPLS-DA模型的置换检验结果的R2Y与Q2均小于未置换前所建立的模型,且Q2有负截距,表明所建立的模型无过拟合(图4D)。从OPLS-DA得分图可得,K562和K562-ADM的细胞代谢物存在明显差别。图4E为OPLS-DA模型中变量的S-曲线,筛选出VIP>1的变量,再以经校正的p值<0.05结合倍数变化(FC>2或FC<0.5)验证2组数据间存在显著性差异,筛选出40个差异特征峰,按照“1.5”方法进行定性分析,结果见表1。
图4 K562和K562-ADM细胞的PCA和OPLS-DA结果Fig.4 PCA and OPLS-DA analysis results of K562 group and K562-ADM groupA:score plot for PCA;B:score plot for OPLS-DA;C:result for OPLS-DA model;D:permutation test result for OPLS-DA;E:S-plot
表1 K562和K562-ADM细胞间的差异代谢物Table 1 Summary of significant changed metabolites between K562 and K562-ADM group
(续表1)
K562和K562-ADM细胞间的差异代谢物的倍数变化如表1所示,与K562细胞相比,K562-ADM耐药细胞中有17种代谢物的水平降低(FC>2),其中L-肉碱和2-甲基鸟苷的水平显著低于K562细胞中的含量;K562-ADM耐药细胞中有23种代谢物的水平升高(FC<0.5),其中腺嘌呤和鸟苷的水平显著高于K562细胞。从代谢途径分析,这些差异代谢物涉及氨基酸代谢、鞘脂代谢、嘌呤代谢以及嘧啶代谢等。其中,L-苯丙氨酸、L-色氨酸、L-甲硫氨酸和L-亮氨酸等氨基酸在K562-ADM细胞中的水平较高。氨基酸是构成蛋白质的基本单位,当氨基酸参与合成的ABC转运蛋白在癌细胞中过表达,而使治疗药物外泵,这是癌细胞产生多药耐药性的重要机制之一[18]。同时,氨基酸也是嘌呤及嘧啶环生物合成的原料,K562-ADM耐药细胞中,参与嘌呤代谢和嘧啶代谢的鸟苷、腺嘌呤和胸苷等物质的含量显著增加,表明耐药细胞可能在细胞增殖中对核苷酸的需求不同于敏感细胞,且嘌呤核苷酸对于细胞内能量的提供和信号传导的作用非常重要。此外,环腺苷酸(cAMP)在K562-ADM耐药细胞的含量降低,cAMP作为一种调控因子,可通过cAMP的蛋白激酶途径调控细胞周期过程的增殖、分化和死亡。有实验表明cAMP随浓度的降低,对K562-ADM耐药细胞增殖的抑制作用减弱,且白血病患者服用cAMP复方制剂可一定程度上改善治疗效果,这证明了cAMP可能调控白血病的多药耐药性[19-21]。此外,α-半乳糖基神经酰胺、鞘氨醇、鞘磷脂(d18∶0/14∶1(OH))和胆碱等物质可能通过鞘脂代谢和甘油磷脂代谢参与细胞膜、线粒体膜等生物膜的构成与功能活动,这些物质以及其它具有差异性的物质在白血病耐药机制方面尚需进一步研究。
3 结 论
本文以人慢性髓系白血病细胞及其阿霉素耐药细胞(K562和K562-ADM)为研究对象,建立了基于UPLC-IT-TOF MS的非靶标代谢组学分析方法。考察了细胞破碎方式、提取溶剂体系和提取溶剂体积对白血病细胞代谢物的提取效果,发现以超声进行细胞破碎,采用800 μL的80%甲醇为提取溶剂,方法简单、可靠,提取到的代谢特征峰较多。采用建立的方法对K562和K562-ADM细胞代谢物进行分析,结果表明:相比K562细胞,K562-ADM耐药细胞中有17种代谢物的含量显著降低,23种代谢物的含量显著增高。差异代谢物主要参与氨基酸代谢、鞘脂代谢、嘌呤代谢和嘧啶代谢等通路,参与代谢的L-苯丙氨酸、L-色氨酸、L-甲硫氨酸和L-亮氨酸等氨基酸和cAMP等物质与已知的白血病耐药性机制相关。此外,其它差异代谢物与白血病耐药性相关的分子机制需要进一步研究。