基于FRET效应的碳量子点/银纳米粒子荧光探针测定西咪替丁的研究

张 洁，张越诚，李承佳，马红燕，李 恒，辛程宏，李昊阳

(延安大学 化学与化工学院，延安市分析技术与检测重点实验室，陕西 延安 716000)

西咪替丁(Cimetidine，CMT)是一种抑制胃酸和胃蛋白酶分泌的常用药物[1]，但长期服用或剂量增大时会出现腹泻、咽喉肿痛等不良现象，有关CMT含量的精准、高效测定一直是研究热点。目前，已报道的测定CMT的方法主要有高效液相色谱法[2]、化学发光法[3]、分光光度法[4-5]、质谱法[6]、毛细管电泳法[7]和荧光法[8]等。荧光法凭借样品用量少、灵敏度高、使用简便等优点而受到青睐。荧光共振能量转移(FRET)[9]是指当两个荧光基团(分别为能量供体和能量受体)距离很近(<10 nm)且能量给体的荧光光谱与能量受体的激发光谱存在大部分交叉时，供体的能量转移至受体而产生荧光信号变化的现象。FRET技术具有高灵敏、方法简便等优点，已成功用于生化样品[10]、食品[11]和金属离子[12]的分析检测。

碳量子点(CQDs)是一种激发和发射波长连续可调、光学稳定性好、毒性低、水溶性好的新型碳纳米材料，被广泛用于环境监测、医学成像和生化分析等领域。目前CQDs的合成大多以富碳物质为碳源，其制备过程复杂且对反应仪器要求较高。近年来，一些利用天然生物质，如蘑菇[13]、红枣[14]、青柿子[15]制备CQDs的方法相继出现，这些方法制备过程简单、成本低且原料绿色环保无毒性。目前基于CQDs的FRET研究已有相关报道[16-18]，其以CQDs作为FRET体系的能量供体，另一物质作为能量受体，如MnO2[16]、溴化乙锭(EtBr)[17]、玫棕酸钠(Sodium rhodizonate)[18]等。而以CQDs为荧光供体，AgNPs为荧光受体，采用FRET技术测定CMT的研究尚未见文献报道。

本文以杨桃(Carambola，CB)为碳源，通过一步水热法合成了强荧光的CB-CQDs。实验发现，CB-CQDs的荧光发射峰位置λem为397 nm，与AgNPs在399 nm处的共振吸收峰之间存在较大程度的重叠，CB-CQDs与AgNPs之间可以发生FRET使CB-CQDs荧光猝灭，荧光信号“关闭”，而向CB-CQDs/AgNPs体系中加入CMT后，CB-CQDs的荧光强度得以恢复，荧光信号重新“打开”。因此基于CB-CQDs /AgNPs之间的FRET效应及荧光信号的“关-开”，提出了以CB-CQDs /AgNPs为探针荧光分析测定CMT的新方法，并对反应机理进行了初步探究。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

F-2700型荧光分光光度计、HT7700型透射电镜(日本日立)；IR Prestige-21型傅立叶变换红外光谱仪、XRD-7000型X-射线粉末衍射仪(日本岛津)；FLSP920瞬态稳态荧光光谱仪(英国爱丁堡)；8453型紫外可见分光光度计(美国安捷伦)。

准确称取CMT标准品(中国药品生物制品检定所)0.025 3 g，加入到20 mL乙醇中搅拌溶解，并超声5 min，待充分溶解后将溶液定容至100 mL容量瓶中，配制成浓度为1.0×10-3mol/L的 CMT标准溶液，置于4 ℃备用。伯瑞坦-罗宾森(BR)缓冲溶液( pH 6.0)。

AgNPs按照参考文献[19]进行制备：分别量取250 μL 0.1 mol/L AgNO3溶液、0.1 mol/L Na3C6H5O7·2H2O溶液及6 mL 5 mmol/L NaBH4溶液，依次滴入90 mL水中并磁力搅拌，滴加完成后再搅拌30 min。将所得产物避光静置8 h后定容至100 mL棕色容量瓶中，置于4 ℃暗室，待用。根据紫外-可见吸收峰强度和对应粒径的摩尔吸光系数[20]计算得到AgNPs浓度为2.5×10-10mol/L。

实验中所用试剂均为分析纯，水为超纯水。杨桃购于当地超市。

1.2 实验方法

1.2.1 CB-CQDs的制备称取33.0 g去皮杨桃，用玻璃棒充分捣碎，置于50 mL 聚四氟乙烯(PTFE)水热反应釜中，加入1.50 mL水，搅拌均匀后置于180 ℃真空干燥箱内反应18 h，待温度降至常温后，依次用滤纸、微滤膜(0.22 μm)过滤，将滤液定容至100 mL容量瓶中，即得到棕黄色CB-CQDs溶液。稀释100倍得到工作液，4 ℃保存备用。

1.2.2 CMT的测定在10 mL比色管中逐一加入上述CB-CQDs工作液2.00 mL、pH 6.0的BR缓冲液2.50 mL、AgNPs溶液2.00 mL以及不同浓度的CMT溶液，以水定容。于室温下反应20 min后，测定λex/λem=319 nm/397 nm下体系的荧光强度IF和未添加CMT溶液的CB-CQDs/AgNPs体系的荧光强度IF0，计算体系荧光恢复值ΔIF(ΔIF=IF-IF0)与CMT浓度之间的关系，λex和λem狭缝宽度均为5 nm。

2 结果与讨论

2.1 CB-CQDs的表征

2.1.1 CB-CQDs的形貌表征采用透射电镜(TEM)对CB-CQDs进行表征，如图1所示，CB-CQDs分散度较好，分布较为均匀，平均粒径为5.8 nm左右。

图1 CB-CQDs的TEM图(A)和粒径分布图(B)Fig.1 TEM image(A) and size distribution(B) of CB-CQDs

2.1.2 CB-CQDs的光谱特性图2A为CB-CQDs在不同激发波长λex下的荧光光谱，由图可知CB-CQDs发射峰的位置λem和强度受激发波长λex的影响，当λex由289 nm递增到349 nm时，发射波长λem由388 nm向长波方向移动至426 nm，荧光强度先增大后减小。实验发现，当λex为319 nm时，λem为397 nm，此时CB-CQDs的荧光强度达到峰值。

使用XRD对CB-CQDs进行晶体结构表征，如图2B所示。2θ=28.64°处为无定形碳的衍射峰，由此判定CB-CQDs的晶型为无定型碳。

图2 CB-CQDs于不同λex下的荧光光谱(A)、XRD图(B)、FTIR图(C)和UV-Vis图(D)Fig.2 Fluorescence spectra of CB-CQDs with different excitation wavelengths(A),XRD spectrum(B),FTIR(C) and UV-Vis absorption spectrum(D) of CB-CQDs

2.2 CB-CQDs/AgNPs体系对CMT的测定

图3A为激发波长λex=319 nm下不同体系的荧光光谱图。由图可知，在该激发波长下，AgNPs、CMT以及二者反应产物均无明显荧光，故实验没有背景影响。向CB-CQDs中加入AgNPs后，前者在λex=319 nm处的荧光强度明显降低，荧光信号“关闭”；向该体系中继续加入CMT，可使猝灭后的CB-CQDs荧光部分恢复，荧光信号重新“打开”。由图3B分析可得，CB-CQDs的荧光恢复值随着CMT浓度的增加而增大，据此可基于该CB-CQDs /AgNPs荧光探针的“关-开”实现对CMT的测定。

图3 不同体系的荧光光谱(A)及随CMT浓度增加CB-CQDs/AgNPs的荧光信号恢复图(B)Fig.3 Fluorescence spectra of different systems(A) and fluorescence signal recovery of CB-CQDs/AgNPs with increasing cimetidine concentrations(B)

2.3 CMT测定条件优化

2.3.1 pH值及缓冲溶液的优化不同pH值的缓冲溶液对CB-CQDs/AgNPs的荧光强度会产生不同程度的影响。考察了pH值(2.0～8.0)对体系荧光强度的影响，实验表明，随着pH值的增加，体系ΔIF逐渐增大，pH 6.0时，体系ΔIF最大，此后随着pH值的增加ΔIF减小，因此实验选择pH 6.0的缓冲溶液。考察了BR、Na2HPO4-NaH2PO4、Na2HPO4-Na3C6H5O7·2H2O、C6H8O7-Na3C6H5O7·2H2O等不同种类的缓冲溶液(pH 6.0)及其用量(0.5～3.0 mL)对体系荧光强度的影响。结果表明，使用2.50 mL的BR缓冲溶液时，体系的ΔIF最大。

2.3.2 CB-CQDs的用量对CB-CQDs的用量(0.5～2.5 mL)进行了优化。在0.5～2.0 mL范围内，随着CB-CQDs用量的增加体系ΔIF增大，当用量为2.0 mL时，体系的ΔIF达到最大值，但用量大于2.0 mL时，体系的ΔIF随着CB-CQDs用量的增加而减小，故实验选择2.0 mL作为CB-CQDs的最佳用量。

2.3.3 AgNPs的用量实验考察了AgNPs溶液用量(0.5～3.0 mL)对体系荧光恢复值ΔIF的影响。随着AgNPs用量的增加，ΔIF增大。加入量为2.0 mL时，体系ΔIF达最大，继续增加AgNPs用量时，体系的ΔIF反而降低。其原因是AgNPs溶液用量过大时，CMT的含量相对降低，从而无法有效抑制FRET效应，故实验选择2.0 mL作为AgNPs溶液的最佳用量。

2.3.4 体系的稳定性向CB-CQDs/AgNPs体系中加入CMT溶液后，测定放置不同时间后体系的荧光恢复值ΔIF。实验结果表明，随着放置时间增加ΔIF增加，并在20 min时达最大，且在8 h内基本保持不变。

2.3.6 检出限及线性范围在选定的反应条件下，体系的ΔIF与CMT浓度在9.0×10-8～1.0×10-6mol/L范围内具有较好的线性关系，其线性方程为ΔIF=9.0×108c(mol/L)+32.713，相关系数(r)为0.998 6，检出限(3σ/k)为1.9×10-8mol/L。

2.4 样品测定

任意选取5片同批号的CMT片，研磨成粉，称取适量(相当于0.025 3 g CMT)药品粉末，超声使其于20 mL无水乙醇中充分溶解后定容至100 mL容量瓶，过滤，取适量滤液按照“1.2.2”方法测定，计算CMT片剂含量。

另于样品溶液中分别加入3个浓度(0.2、0.5、0.8 μmol/L)水平的标准样品，反应20 min后，依次对各个样品的3组混合液进行荧光强度测定，每组测定5次，计算ΔIF。根据标准曲线代入线性方程计算，回收率结果见表1。其加标回收率为97.5%～102%，相对标准偏差(RSD)小于3.0%，表明CB-CQDs/AgNPs荧光探针可用于实际CMT样品的检测。

表1 CMT样品测定及回收率实验(n=5)Table 1 Determination results of cimetidine in sample and recovery of the method(n=5)

2.5 反应机理初探

为探讨AgNPs对CB-CQDs的荧光猝灭机理，首先对CB-CQDs和CB-CQDs/AgNPs体系的荧光寿命进行了测定，前者的加权平均荧光寿命[22]为3.32 ns，后者为1.58 ns，加入AgNPs后荧光寿命减小，表明AgNPs对CB-CQDs的猝灭为动态猝灭。

其次，扫描了CB-CQDs的荧光光谱和AgNPs的UV-Vis光谱，如图4A所示。CB-CQDs荧光发射峰λem位置为397 nm(图4A左侧纵坐标)；AgNPs 在399 nm处有一共振吸收峰(图4A右侧纵坐标)，将CB-CQDs和AgNPs分别作为体系的能量供体与受体，二者峰之间存在较大程度的重叠，且该体系的分子间距小于10 nm，符合发生FRET的要求。据此可以推断，AgNPs对CB-CQDs的荧光猝灭作用是FRET效应。

图4 CB-CQDs的荧光光谱和AgNPs的UV-Vis图(A)以及不同浓度CMT加入AgNPs中的UV-Vis图(B)Fig.4 Fluorescence spectrum of CB-CQDs and UV-Vis absorption spectrum of AgNPs(A),and UV-Vis absorption spectra of different concentrations of cimetidine added to AgNPs(B)

图4B为AgNPs溶液中加入不同浓度CMT溶液时的吸收光谱。由图可知，在波长为399 nm处，CMT溶液的浓度越大，AgNPs的吸收峰越低。原因可能是AgNPs溶液中含有的柠檬酸盐使得AgNPs较为分散，此时AgNPs吸收峰较高；而CMT的加入使AgNPs产生团聚[23]，从而导致AgNPs吸收峰强度下降，并使得AgNPs与CB-CQDs间的FRET效应被阻隔，导致CB-CQDs荧光恢复。反应的可能机理见图5。

图5 CMT检测机理图Fig.5 Principle diagram for detection of cimetidine by the established system

3 结 论

通过一步水热法制备了荧光性能好、水溶性好的绿色CB-CQDs。基于AgNPs与CB-CQDs间的FRET作用使CB-CQDs荧光猝灭及CMT与AgNPs间的团聚作用使荧光重新恢复的现象，实现了荧光的“关-开”响应，并建立了以CB-CQDs /AgNPs为荧光探针的CMT检测新方法。该研究拓宽了CQDs在药物分析领域的应用范围。