狗枣猕猴桃多酚对60Coγ射线辐射损伤小鼠免疫系统保护作用的研究

左丽丽 ， 李昰奇 ， 富校轶 ， 高永欣 ， 王振宇 ， 王舒然

(1.吉林医药学院公共卫生学院 ， 吉林 吉林 132013 ; 2.哈尔滨工业大学化工与化学学院 ， 黑龙江 哈尔滨 150090)

随着科技的不断进步，辐射已经渗透到生活的各个领域，辐射造成的损伤日益严重[1-4]。辐射会导致机体产生大量的活性氧自由基，自由基攻击DNA、蛋白质、脂质等生物大分子，从而产生一系列的链式反应，最终诱发机体的衰老、免疫力低下、炎症、癌症等一系列疾病。辐射防护剂普遍存在毒副作用，能够诱导机体正常的器官和组织损伤，不宜长期服用。因此寻找高效、无毒或低毒、适宜人类长期服用的辐射防护剂是目前亟待解决的关键问题[5-8]。狗枣猕猴桃是东北地区的野生浆果，含有大量的活性成分。通过前期研究发现，多酚是狗枣猕猴桃果实中重要的功效成分，具有抗氧化、抗辐射、抗肿瘤、提高机体免疫力等多种功能活性[9-11]。本文通过建立辐射诱导的氧化损伤模型，主要研究狗枣猕猴桃多酚在造血及免疫系统方面的辐射防护作用，旨在为其作为辐射防护剂提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 狗枣猕猴桃野生浆果采摘于黑龙江省大兴安岭地区；狗枣猕猴桃多酚(AKP，纯度38.6%)由哈尔滨工业大学化工与化学学院制备；清洁级雄性昆明系小鼠6～8周龄，体重(22±2)g，许可证号：SCXK(黑)2013-001，购自哈尔滨医科大学肿瘤医院动物实验中心；利可君片由江苏吉贝尔药业有限公司生产；IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ试剂盒，均购自南京建成科技有限公司。

1.2 仪器与设备 HR2006型料理机，购自飞利浦电子香港有限公司；TDZ4-WS型低速离心机，购自湖南湘仪实验仪器有限公司；Sp-752PC型紫外可见分光光度计，购自北京光谱仪器有限公司；RE-3000旋转蒸发仪，购自上海亚荣生化仪器厂；KQ-5200超声波清洗器，购自昆山市超声仪器有限公司；FD-18真空冻干机，购自上海田枫实业有限公司；HT-2 酶标仪，购自Biocell公司。

1.2 方法

1.2.1 小鼠辐射损伤模型的建立60Coγ射线诱导的小鼠氧化损伤模型见文献[11]，辐射后第2天摘眼球取血，脱臼处死小鼠，迅速剥离小鼠的肝、脾等组织，放置在4 ℃预冷的生理盐水中清洗3次，去除血污及其结缔组织，然后用滤纸将脏器表面的水分充分吸干，称重并记录数据。

1.2.2 外周血白细胞计数 准确吸取380 μL白细胞稀释液加入20 μL血液，充分混匀后，吸取少量白细胞混悬液滴入血球计数板计数池内，静置2～3 min，待白细胞沉降后进行计数分析。在低倍镜下观察，白细胞近似成圆形，胞浆透亮，细胞核呈现紫黑色，并稍有折光。计数是计数池四角的4个大方格中所有的白细胞数。按照公式(1)进行计算：

I=A/4×N×107

(1)

I:白细胞数目(个/L)；A:4个大方格中所有的细胞数；N:稀释倍数

1.2.3 碳廓清试验 小鼠辐射24 h后，将印度墨汁原液用生理盐水稀释5倍后，按照0.1 mL/(10 g·bw)，从尾静脉缓慢注入稀释好的印度墨汁，待墨汁注射完毕，用秒表立即开始计时。注射墨汁结束后的2 min、10 min，使用预先用抗凝剂处理好的毛细管分别从小鼠眼眶静脉丛取血20 μL，立即将其加入到2 mL 0.1% Na2CO3溶液中，在600 nm波长下测定吸光度值。随后将小鼠脱臼处死，立即剖检取其肝脏和脾脏，清洗血污，称重并记录数据。按照公式(2)、(3)分别计算吞噬指数及校正吞噬指数，以此来表示机体吞噬细胞的吞噬能力[12-13]。

吞噬指数k=(lgA1-lgA2)/(t2-t1)

(2)

校正吞噬指数a=体重×k1/3/(肝重+脾重)

(3)

k：直线斜率，表示吞噬速率；a：反应每单位组织重量的吞噬活性；A1:t1血标本的吸光度值；A2:t2血标本的吸光度值；t1:注入墨计后第1次采集血标本的时间；t2:注入墨计后第2次采集血标本的时间。

1.2.4 细胞因子白介素的测定 脾淋巴细胞悬浮液的制备[14]：在无菌条件下剖检小鼠取出脾组织，将其放置到盛有适量的无菌Hank′s液培养皿中，使用镊子将脾组织轻轻磨碎，制成单细胞悬浮液。然后使用200目筛网过滤细胞，用Hank′s液充分洗涤细胞2次，每次以1 000 r/min的速度离心10 min。然后将细胞悬浮于1 mL的新鲜培养液中，用台盼蓝对其进行染色并记录活细胞数量(应在95%以上)，最后调整细胞浓度为2×106个/mL左右。按照1 mL/孔的量加入到24孔培养板中，并设置3个重复，每孔加入50 μL的Con A(终浓度为7.5 μg/mL)，置于37 ℃、5%的CO2培养箱中培养72 h，离心收集上清液测定其中细胞因子含量[15-17]。细胞因子白介素IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ的测定按照试剂盒说明书进行操作。

1.3 统计与分析 每组进行3次平行试验，数据以平均值±标准差表示，采用Original 8.5进行统计分析。

2 结果

2.1 AKP对外周血白细胞数量的影响 机体经过γ射线照射后，会造成体内白细胞数量出现不同程度降低，从而导致机体对抗外界细菌入侵的能力下降[18]。通过白细胞计数发现，辐射后模型组与对照组相比白细胞数极显著降低(P<0.01)，如图1所示，给药阳性对照组白细胞得到一定程度的恢复，AKP给药组使白细胞的数量都有显著上升趋势，随着AKP浓度的升高，低、中剂量组白细胞数也逐渐升高，中剂量组的升高趋势超过了阳性对照利可君片组，但高剂量组相比模型组也有升高，但不及中、低剂量组。因此，AKP具有很好的增加白细胞的能力，提高机体的免疫力。

图1 AKP对辐射小鼠外周血白细胞的影响

2.2 AKP对白细胞中不同细胞形态变化的影响 显微镜下白细胞的形态变化，如中插彩版图2所示，白细胞主要包括粒细胞和淋巴细胞，空白对照组体内细胞正常，细胞膜完整清晰可见，当辐射后，细胞受到不同程度的伤害，分叶细胞内部会出现空泡，细胞膜破裂，淋巴细胞也会出现异型，显示出辐射对机体造成了损伤。每个片子随机计数100个白细胞，并记录不同形态的细胞数。如图3所示，氧化伤害后模型组损伤的细胞数显著增加，而AKP和利可君片加药组能够明显降低白细胞的损伤程度，对粒细胞和淋巴细胞的完整性都起到不同程度的防护作用。

图3 外周血白细胞计数分析各类细胞损伤情况

2.3 AKP对小鼠胸腺指数和脾脏指数的影响 胸腺是生物体重要的中枢免疫器官，同时也是T细胞发育及分化的主要场所，它的功能是介导细胞免疫，调节机体的免疫功能[19-20]。γ-射线照射小鼠，根据其体重、脾脏和胸腺的质量分别计算脾脏指数和胸腺指数，结果如表1所示。与正常对照组相比，机体受到辐射后脾脏指数和胸腺指数极显著降低(P<0.01)，这表明脾脏和胸腺受到严重的损伤，导致免疫器官细胞的损伤或凋亡。与模型组相比，给药组利可君片使脾脏和胸腺指数极显著提高(P<0.01)，AKP不同浓度的剂量组也不同程度的提高了小鼠的脾脏指数和胸腺指数，且中剂量组效果最佳，但是不及利可君片组。因此，AKP和利可君片均可提高辐射小鼠的脾脏指数和胸腺指数，减少辐射对机体造成的损伤，同时在一定程度上也促进了免疫器官的恢复。

表1 狗枣猕猴桃多酚对小鼠脾脏指数和胸腺指数的影响

2.4 AKP对巨噬细胞吞噬能力的影响 非特异性免疫是机体免疫系统重要的组成部分，单核巨噬细胞的吞噬能力能够有效反映动物的非特异性免疫功能。小鼠尾静脉注射印度墨汁，其碳粒迅速被肝脏、脾脏等器官内皮网状细胞吞噬而使其血浆浓度下降，因此，其廓清速率间接反映单核巨噬细胞系统的吞噬功能[19]。由表2可以看出，辐射后模型组吞噬指数明显降低，与正常对照组相比具有显著性差异(P<0.05)，表明该组中小鼠的免疫功能受到严重的抑制，利可君片组以及灌胃AKP的低剂量组吞噬指数显著升高(P<0.05)，中剂量和高剂量组与模型组相比吞噬指数也有显著提高，碳廓清指数与模型组比较有显著的改善(P<0.05)，但低于正常对照组，且中、高剂量组之间差异不显著，即AKP能够增强巨噬细胞的吞噬功能，加速对碳粒的清除。

表2 狗枣猕猴桃多酚对小鼠吞噬指数的影响

2.5 AKP对辐射诱导的小鼠脾淋巴细胞形态的影响 淋巴细胞是对辐射非常敏感的器官，一旦受损就会导致机体的免疫力下降[15,20]。图4显示显微镜下观察到空白对照组脾淋巴细胞为圆形或椭圆形，边缘整齐，大小均一。辐射后脾淋巴细胞数量变少，细胞多呈不规则形，胞膜边缘不整齐，染色质粗糙，呈粗网状或成堆排列，细胞内超微结构发生变化，机体的免疫力急剧下降。辐射前给予机体不同浓度的AKP能够显著的改善脾淋巴细胞的形态，低、中剂量组随着浓度的升高脾淋巴细胞的数量也逐渐增多，细胞的形态也趋于正常化，中剂量组优于高剂量组。而利可君片组能够使脾淋巴细胞的数量和形态基本恢复正常化，引起脾淋巴细胞以及DNA、RNA含量的增加，这表明AKP和利可君片均能够有效提高机体的免疫力。

图4 脾淋巴细胞的形态(40×)

2.6 AKP对白介素IL-2生成能力的影响 IL-2主要激活CD4+T1细胞的产生，又称作T细胞生长因子，能够引起T细胞的增殖，使T细胞激活并进入分裂状态，而T细胞的活化又抑制机体的特异性免疫应答[15]。IL-2的标准曲线方程为y=0.002 44x-0.012 48，R2=0.999 84，脾淋巴细胞中IL-2的含量如图5所示，辐射后模型组小鼠的脾细胞中IL-2的含量显著降低(P<0.01或P<0.05)，辐射前灌胃不同剂量的AKP和利可君片能够显著促进脾淋巴细胞中IL-2细胞因子的分泌，与模型对照组相比，存在显著性的差异，并随着给药剂量的增加，机体IL-2的分泌量也不断升高，尤其是对高剂量组脾细胞中IL-2的作用更显著，存在着明显的剂量效应关系。

图5 AKP对小鼠脾细胞中IL-2生成能力的影响

2.7 AKP对白介素IL-4生成能力的影响 IL-4被认为是典型的由Th2细胞产生的细胞因子，随着IL-4的激活，Th2细胞随后产生附加的IL-4[21]，对于T、B淋巴细胞的发育以及调节体液免疫和适应性免疫起关键作用[22-23]。IL-4的标准曲线方程y=0.001 19-0.032 89x，R2=0.995 01，辐射损伤后小鼠脾淋巴细胞中IL-4的含量如图6所示，辐射后机体脾淋巴细胞中IL-4的含量有少量的降低，灌胃不同剂量的AKP和利可君片可促进机体脾淋巴细胞中IL-4的分泌，但提高不显著，只有高剂量的AKP显著提高了脾淋巴细胞中IL-4的含量，其他剂量组之间也没有显著性差异。这表明AKP对机体分泌IL-4因子的效果不显著。

图6 AKP对小鼠脾淋巴细胞中IL-4生成能力的影响

2.8 AKP对白介素IL-10生成能力的影响 IL-10是抗炎因子，是几个免疫反应重要的调节器。IL-10的标准曲线线性方程y=8.831 17E-4x+0.083 52，R2=0.998 6，辐射后小鼠脾淋巴细胞中IL-10的含量如图7所示，辐射后小鼠脾淋巴细胞中IL-10的含量极显著降低(P<0.01)。灌胃AKP能够有效的提高机体中IL-10的含量，从而增加机体的免疫水平。利可君片没有提高脾淋巴细胞中IL-10的含量，而中、高剂量组的AKP能够显著的促进IL-10的分泌，但是与正常对照组之间还存在一定的差异(P<0.05)。

图7 AKP对氧化损伤小鼠脾淋巴细胞中IL-10生成能力的影响

2.9 AKP对干扰素IFN-γ生成能力的影响 IFN-γ可诱导细胞因子的产生、上调Fc受体和白血细胞粘附因子等的表达。IFN-γ通过与其特异性的细胞表面受体高亲和力的结合，而发挥生物学活性[24-25]。IFN-γ标准曲线线性方程y=0.003 3x+0.115 54，R2=0.994 46。辐射后小鼠脾淋巴细胞中IFN-γ的含量，如图8所示，辐射导致机体脾淋巴细胞中IFN-γ的含量极显著降低(P<0.01)，灌胃不同剂量的AKP和利可君片后机体内IFN-γ的含量不同程度的提高，但是组间没有显著性差异，且相对于正常对照组也还有一定的差异，这表明AKP促进了机体中IFN-γ的分泌，显著提高机体的免疫能力。

图8 AKP对氧化损伤脾淋巴细胞中IFN-γ生成能力的影响

3 讨论

已有研究表明，辐射后机体的各个系统、器官以及组织都有可能受到损伤，其中造血组织最为敏感，造血组织损伤是机体最早出现的基本损伤之一[26-27]。射线会对机体的造血系统产生影响，射线作用于骨髓造血干细胞，使得细胞增殖能力下降，造血功能受阻，最直接的表现为外周血象降低[28-29]。本试验结果显示，辐射导致小鼠外周血白细胞数量急剧减少，白细胞损伤严重，AKP的低、中、高剂量组使得辐射小鼠血液白细胞有一定程度的恢复，且分叶带空泡粒细胞和破碎细胞的数量减少，表明AKP对造血系统有一定的保护作用。

胸腺和脾脏是机体2个重要的免疫器官，因此,动物试验中脾脏指数和胸腺指数广泛被用来作为免疫功能指标进行检测。张成强等研究显示，辐射导致小鼠脾脏和胸腺指数显著降低，而葡萄籽多酚和蓝莓多酚能够明显改善辐射小鼠的胸腺指数，并对脾脏指数有一定程度的提高[30]。本试验也发现，AKP低、中、高剂量组的胸腺指数和脾脏指数均高于模型组，且中剂量组效果最好，提示AKP能够保护胸腺和脾脏，也就是说，AKP对免疫系统有一定的保护作用。另外，对单核巨噬细胞吞噬功能的影响研究也提示，AKP有提高辐射小鼠免疫功能的作用，从而进一步保护辐射小鼠形成免疫抑制等现象。

细胞因子是一类由活化的免疫细胞(淋巴细胞以及单核巨噬细胞)和相关细胞产生的具有调节细胞功能的高活性、多功能蛋白质多肽分子或糖蛋白，是免疫系统重要的信息分子，在免疫调节中充当重要的角色。程翠林的研究发现,辐射后小鼠脾淋巴细胞免疫因子(IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ)出现不同程度的下降[31]。本试验也发现相同的结果，摄入不同浓度的AKP均能提高由刀豆蛋白刺激的辐照小鼠脾淋巴细胞的增殖与转化，并可以显著提高小鼠脾脏中IL-2的分泌，诱生IFN-γ，促进T、B淋巴细胞的分化以及细胞毒性T淋巴细胞成熟，增强小鼠机体细胞免疫能力，同时促进IL-10的分泌，下调免疫抑制，维持机体的健康，即AKP通过促进体内细胞因子的分泌，特定的激活细胞调节的免疫反应，从而有效的提高机体的免疫力。初步证实了AKP对辐射诱导的免疫损伤具有一定的保护作用，为其进一步开发及应用提供了科学依据。