观赏鸡中禽白血病病毒分离鉴定及全基因测序分析

刘福林 ， 曹 红 ， 王亚楠 ， 武沛泽 ， 海 伟 ，王宏钧 ， 李 三 , 余德海 ， 陈福勇 ， 常建宇

(1.中国农业大学动物医学院 ， 北京 海淀 100193 ； 2.四川天兆猪业股份有限公司 ， 重庆 渝北 401100)

禽白血病(Avian leucosis, AL)是由禽白血病病毒(Avian leukosis virus, ALV)感染引起的，主要以造成被感染动物细胞恶性增生的肿瘤疾病为主要特征。根据囊膜蛋白抗原性的不同，ALV分为 A～J共10个亚群。其中在鸡群中流行的 A、B、C、D四个亚群是1980年以前确定的，在鸡群中诱发肿瘤的主要是 A、B亚群ALV。C、D亚群在临床上少见，报道较少。E亚群则是普遍存在的内源性禽白血病病毒，对宿主无致病性。F～I亚群ALV分离自鸡以外的宿主动物，而J亚群是20世纪90年代初从肉鸡中分离到的一种新型外源性病毒[1]。近年的ALV流行病学调查结果表明，我国禽白血病病原主要为J亚型，该病毒给养禽业带来了严重的经济损失[2-5]。目前国内商业蛋鸡、肉鸡及地方品种鸡都有感染禽白血病的报道[6-9]。

元宝鸡作为名贵的观赏鸡，有一定的观赏价值，它体型娇小、生性活泼，深受世人喜爱。迎合全球发展微型特种禽的潮流，被誉为绝世珍品。国内元宝鸡养殖业刚刚起步，其经济效益是普通鸡的3～4倍，国内外市场潜力巨大，是高效农业的新项目。目前国内尚无关于其禽白血病方面的报道，因此对其进行禽白血病的调查很有必要。本试验从观赏元宝鸡血浆中分离1株禽白血病病毒，并命名为BJ1401。完成其全基因序列的测定，并将测序结果与已发表序列进行同源性分析和制作进化树。本试验为防控和净化元宝鸡鸡群中禽白血病提供理论依据，并可丰富中国地方品种鸡的分子流行病学资料。

1 材料与方法

1.1 试验材料 血浆样品来自于北京某观赏禽交易市场，鸡品种为元宝鸡。禽白血病抗原检测试剂盒为美国IDEXX产品。DF-1细胞由本实验室保存。DMEM、FBS、胰酶，均购自Gibco公司。DH5α、克隆用PEGM-T载体、工具酶、组织/细胞DNA提取试剂盒，为北京全式金生物技术有限公司。

1.2 病毒的分离和鉴定 参照王笑梅的方法[10]，将待检测的血浆样品接种于DF-1，同时设DF -1细胞阴、阳性对照。细胞上清ALV p27抗原ELISA检测按照抗原检测试剂盒(IDEXX)使用说明书进行。上清为阳性的样品，细胞沉淀用于提取ALV前病毒基因组DNA。

1.3 ALV前病毒DNA的制备 收集阳性上清细胞沉淀，按照Genomic DNA Kit说明书制备ALV前病毒基因组DNA。

1.4 引物合成和基因组cDNA的PCR扩增 参考张青婵的论文[11]合成5对连续且相互重叠覆盖全序列的引物，引物序列见表1，以1.3中样品为模板进行PCR扩增。全部引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 引物核苷酸序列

1.5 核酸序列片段克隆和测序 取PCR已纯化产物1 μL连入5 μL pEGM-T载体，转化DH5α，选阳性菌液送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

1.6 核酸序列的相似性比较和进化分析 应用DNASTAR软件，对6个PCR片段克隆的测序结果进行拼接，将获得的BJ1401株前病毒基因组核苷酸序列与国内外公开发表的病毒株进行遗传进化及相似性比较分析。参考毒株为： RAV-1 (A亚群代表株)、MQNCSU (A亚群美国株)、MAV-1、SDAU09C3 (A亚群中国株)，SDAU09C2 (B亚群中国株)，ev-1(E亚群代表株)、SDO501 (E亚群中国株), Prague C (C亚群代表株),RSV-SR-D (D亚群代表株), HPRS103(J亚群原始毒株)，基因库登录号依次为: M19113、DQ365814、L10922、HM452340、HM446005、AY013303、EF467236、J02342、D10652、Z46390。

2 结果

2.1 病毒的分离及鉴定 观赏型元宝鸡鸡群的血浆接种DF1细胞后，经过传代获得细胞上清，p27检测为阳性，获得1株外源ALV，命名为BJ1401。

2.2 BJ1401株基因组cDNA的PCR扩增 利用5对扩增cDNA的全基因组引物进行PCR扩增，均扩增出了5段与预期大小相符的DNA片段(图1)。

2.3 BJ1401株基因组序列结构 利用DNASTAR软件对BJ1401株的测序结果进行拼接，获得了其cDNA全序列。BJ1401株序列全长7 503 bp, 其中gag基因长为2 106 bp；pol基因长为2 687 bp;env基因长为1 799 bp; 两端相同的LTR均长为283 bp。

2.4 BJ1401株核苷酸序列比对 利用DNASTAR软件分析表明，BJ1401株gag基因核苷酸与各亚群参考株同源性在95.5%～99.0%，与E亚群相似性最高(99.0%)。pol基因核苷酸与各亚群参考株同源性在97.3%～99.6%，与E亚群相似性亦最高(99.6%)。gp85基因核苷酸序列与C亚群Prague C株相应核苷酸序列相似性最高(91.6%)，与J亚群原型株HPRS-103相似性最低(50. 3%)，与各代表株的核苷酸序列相似性在50.3%～91.6%。gp37核苷酸序列与E亚群同源性高达98.2%，与A、B、C、D亚群，相应序列同源性在92.7%～94.3%，与J亚群同源性只有59.5%。LTR核苷酸序列与E亚群同源性最高(91.6%)，与其他各亚群同源性低于68.0%(表2)。

表2 BJ1401株各核苷酸片段与不同亚型毒株相应核苷酸序列的同源性

2.5 BJ1401株核苷酸序列的进化分析 利用MEGA6.0软件对BJ1401株部分核苷酸片段进行进化分析表明，BJ1401株gp85核苷酸序列与C亚群美国株Prague C的亲缘关系最近，与C亚群同在一个进化支上，与J亚群ALV分离株相比，A、B、C和E亚群ALV分离株亲缘关系较近，同属一个大的进化支(图2)。gp37核苷酸序列与E亚群ev-1及SD0501株亲缘关系最近，与E亚群同在一个进化分支上(图3)。LTR核苷酸序列与E亚群ev-1、SD0501株亲缘关系亦最近(图4)。

图2 BJ1401株gp85基因的系统进化树

图3 BJ1401株gp37基因的系统进化树

图4 BJ1401株LTR基因的系统进化树

3 讨论

国内己经有很多关于禽白血病的报道，但主要集中在家禽上，尚无有关观赏性元宝鸡感染禽白血病的报道。本试验报道了观赏性元宝鸡中存在禽白血病病毒的感染，由于目前样本数量较少，不能有效计算其感染率，还需要进一步加大样本采集进行检测，并分析其基因特征，以便掌握元宝鸡鸡群中流行的禽白血病的分子特征。为确保我国具有经济价值的观赏禽免受禽白血病等肿瘤疾病的侵害，我们应掌握元宝鸡中禽白血病的流行动态，以便采取相应的保护和防控措施。

BJ1401株gag和pol基因核苷酸序列相对保守，但同源性显示更接近于E亚群。gp85基因核苷酸序列与C亚群同源性最高，并且处在同一进化分支上，gp37、LTR基因核苷酸序列与E亚群相应序列同源性最高，且遗传关系也最近。因此，仅从同源性和遗传进化角度分析，元宝鸡中分离株BJ1401很可能是C亚群E亚群禽白血病病毒重组的结果。虽然BJ1401株具有内源性E亚群的全基因主干，但它具有外源性病毒的gp85基因，因此可以在DF-1细胞上感染和增殖。

我国地域辽阔，气候地理条件多种多样，各地饲养着许多不同特性和不同遗传背景的地方品系鸡群。长期以来，这些鸡群可能一直存在着ALV感染，但从来都没有做过ALV的净化，地方品系鸡存在不同基因组结构的ALV的可能性就很大。因此，本试验从我国观赏性鸡群中分离1株不同于己知6个亚群ALV的基因结构就不足为奇了。但是，对于该毒株对鸡的致病性及其生物学特性有待进一步研究。