大鼠血浆中木兰花碱浓度的测定

2020-07-28殷永红

化学研究 2020年2期

杨林, 殷永红*

(1.鄂东医疗集团黄石市中心医院(湖北理工学院附属医院)，湖北黄石 435000; 2.肾脏疾病发生与干预湖北省重点实验室, 湖北黄石 435000)

木兰花碱(图1A)，又名木兰碱，别名唐松草碱，是从中药木兰或马兜铃中分离得到的生物碱类化合物[1].木兰花碱被证实具有多种生物学活性，降血压、抗焦虑、抗肿瘤、抗炎、抗生育及消除运动性疲劳等作用[2-4]，具有非常广阔的开发前景.

目前已有多篇文献报道采用高效液相色谱法(HPLC-UV)测定中药及复方中的木兰花碱含量[5-6]，也有采用HPLC-UV法测定木兰花碱血药浓度并研究大鼠体内药代动力学的报道[7].本文拟采用高效液相色谱-串联质谱法建立并验证大鼠血浆中木兰花碱的浓度，并将该法应用到木兰花碱在大鼠体内的药代动力学研究中.方法灵敏、快速、准确、稳定，可以应用到木兰花碱临床前的其他方面的研究中，并为该药物的开发利用打下基础.

图1 木兰花碱(A)和小檗碱(内标，B)的结构式Fig.1 Chemical structure of magnoflorine (A) and berberine (IS, B)

1 实验部分

1.1 仪器

美国Finnigan公司TSQ Quantum Discovery MAX 型液质联用系统(LC-MS /MS，美国Finnigan公司)；赛多利斯Sartorius BS110S电子分析天平(北京赛多利斯科学仪器有限公司)；DC150-1A 96孔氮吹仪(杭州佑宁仪器有限公司)；AS3120A(铝)型超声波清洗器(天津奥特赛恩斯仪器有限公司)；Thermo Micro17R微量台式冷冻离心机(美国Thermo公司)；WH-2 微型漩涡混合器(上海沪西分析仪器厂).

1.2 试药

木兰花碱对照品购自西安汇林生物科技有限公司；盐酸小檗碱对照品(内标，批号110713-201814)购自中国食品药品检定研究院.色谱纯甲醇、乙腈购自美国TEDIA(天地)试剂公司；水为娃哈哈饮用纯净水(杭州娃哈哈集团有限公司).

1.3 色谱及质谱条件

色谱条件：色谱柱为Kromasil Eternity-5 C18 色谱柱(2.1 mm × 50 mm，5 μm)；流动相为水(A)-乙腈(B)梯度洗脱，洗脱程序为：0～0.2 min，B保持20%；0.2～1.0 min，B由20%增加为60%；1.0～2.0 min，B由60%增加为95%；2.0～2.01 min，B由95%变为20%；2.01～3.0 min，B保持20%.流速0.6 mL·min-1；柱温设置为30 ℃，进样体积为10 μL.

质谱条件：采用电喷雾离子化(ESI)电离源；扫描方式为选择反应监测(SRM)，正离子模式.喷雾电压3 500 V；加热毛细管温度(TEM)为270 ℃；鞘气流速30 psi；辅助气流速15 psi；碰撞气(CID)压力为1.5 mTorr；源内碰撞解离电压(Source CID)为10 V；木兰花碱与小檗碱(内标)的检测离子对分别选择：m/z342.4→297.3和m/z335.8→320.2(图2)，碰撞电压分别为：24 eV、18 eV[8].

图2 木兰花碱(A)和小檗碱(内标，B)的质谱图Fig.2 Mass spectrogram of Magnoflorine (A) and Berberine (IS, B)

1.4 对照品溶液的制备

精密称取适量的木兰花碱对照品，置于10 mL容量瓶中，加入甲醇溶液使之溶解完全，并定容至刻度，配制成木兰花碱浓度为10 g·L-1的对照品储备溶液，置于4 ℃冰箱内保存.临用之前，再用甲醇将储备液逐级稀释成浓度为2、10、40、100、250、500 μg·L-1的木兰花碱标准系列溶液.

1.5 内标物溶液的制备

精密称取盐酸小檗碱对照品适量，置于10 mL容量瓶中，加入甲醇溶液使之完全溶解，并定容至刻度，配制成小檗碱浓度为1 g·L-1的内标对照品储备溶液，保存于4 ℃冰箱内.临用之前，用甲醇将内标对照品储备溶液稀释成浓度为400 μg·L-1小檗碱(内标)工作溶液.

1.6 血浆样品的处理

精密量取100 μL待测大鼠血浆样品置于1.5 mL离心管中，精密加入10 μL小檗碱(内标)工作溶液(400 μg·L-1)，充分振荡，待完全混匀后，再向离心管中加入500 μL乙酸乙酯溶液，充分振荡约3 min，使之完全混匀.于4 ℃下以14 000 r/min的转速离心10 min后，静置分层，定量吸取上清乙酸乙酯溶液置于氮吹浓缩仪中进行浓缩，待乙酸乙酯溶液吹干后，加入100 μL甲醇溶液复溶，再于4 ℃下以14 000 r/min的转速离心10 min后，取上清液上样，每个样品定量吸取10 μL注入LC-MS/MS系统，进行浓度分析.

2 结果与讨论

2.1 方法建立

在考察血浆样品前处理时，分别尝试了直接沉淀法、液液萃取法以及固相萃取法.结果发现，采用直接沉淀法处理大鼠血浆样品后，在分析物出峰位置有明显的干扰，导致专属性较差，分析定量不准确；而固相萃取法需要较长的处理时间，并且成本较高.最后选用液液萃取法进行样品的前处理，既能保证良好的专属性，还能降低实验的成本，适合于大鼠的血浆样品处理.

另外，还考察了不同型号的色谱柱和流动相组成及比例，最后选用Kromasil Eternity-5 C18 色谱柱(2.1 mm × 50 mm，5 μm)；流动相采用水和乙腈梯度洗脱，得到了理想的峰形和合适的质谱响应.

2.2 方法学考察

2.2.1 专属性

根据“1.6血浆样品的处理”项下的血浆样品处理方法，分别制备空白大鼠血浆样品、加入木兰花碱和小檗碱(内标)标准溶液的大鼠血浆样品和大鼠灌胃给药后1 h获得的血浆样品，并采用“1.3 色谱及质谱条件”项下的色谱及质谱条件获得相应的色谱图，结果发现空白血浆样品在木兰花碱和小檗碱(内标)的出峰时间不存在干扰，证明该方法具有良好的专属性，见图3.

A: 木兰花碱; B: 小檗碱(内标); I: 空白大鼠血浆样品; II: 空白大鼠血浆加入木兰花碱和小檗碱(内标)溶液样品; III: 大鼠给药后1 h的血浆样品图3 典型色谱图Fig.3 Typical chromatogram

2.2.2 标准曲线的建立

分别取木兰花碱标准系列溶液10 μL，置于90 μL大鼠空白血浆中，充分振荡1 min，配制成浓度为0.2、1、4、10、25、50 μg·L-1的大鼠血浆标准溶液.其他操作同“1.6 血浆样品的处理”项下所述.质控样品(QC)采用木兰花碱浓度为4、50和400 μg·L-1的标准溶液制备，同法制得木兰花碱终浓度分别为0.4、5和40 μg·L-1的QC样品，测定条件同上.以木兰花碱与小檗碱(内标)的响应比值为纵坐标(Y)，以木兰花碱的质量浓度为横坐标(X)进行线性回归，权重选择W=1/X2，得到的回归方程为Y=0.004 5X+0.068(n=5，R2=0.991 2).结果表明，木兰花碱在0.2～50 μg·L-1的范围内线性关系良好，定量下限为0.2 μg·L-1.

2.2.3 精密度与准确度

采用低、中、高三个浓度的QC样品(n=6)考察木兰花碱在大鼠空白血浆中的精密度和准确度，连续测定3 d，分别考察日内和日间精密度(RSD)与准确度，每日的测量采用随行标准曲线定量.实验结果表明，低、中、高3个浓度的QC样品的日内和日间精密度(RSD)均小于15%，准确度在85%～115%的范围内，符合临床前药代动力学指导原则对生物样品浓度测试的要求(见表1).

2.2.4 提取回收率与基质效应

采用三个浓度的QC样品(n=3)考察木兰花碱在大鼠空白血浆中的提取回收率和基质效应.正常处理的QC样品响应为A；大鼠血浆处理后加入QC标准溶液的样品响应为B，无基质的QC样品响应为C.A/B为提取回收率，B/C为基质效应.结果见表2.

表1 大鼠血浆中木兰花碱的精密度和准确度(n=6)

表2 大鼠血浆中木兰花碱的提取回收率和基质效应(mean±SD，n=3)

2.2.5 稳定性

采用低、高两个浓度的QC样品(n=6)考察木兰花碱在不同条件下在大鼠血浆中的稳定性.分别考察上清液样本在自动进样器中放置24 h的稳定性；血浆样品在实验台放置6 h的稳定性；冻融三个循环的稳定性以及-30 ℃冷冻10 d的稳定性，结果表明木兰花碱在上述贮存及实验过程中稳定(表3).

表3 大鼠血浆中木兰花碱的稳定性( mean±SD，n=5)

LC-MS/MS法较前人报道的HPLC-UV法[7]有极大的改进，分析时间由超过20 min缩短为3 min，灵敏度由0.5 mg·L-1提高到0.2 μg·L-1，并提高了分析方法的专属性.且准确性和稳定性符合临床前生物样品测试的要求.

2.3 药代动力学研究

5只SD大鼠给药前至少禁食12 h，自由饮水.木兰花碱对照品采用1%的羧甲基纤维素钠溶液均匀分散，配制成浓度为1 g·L-1供试品溶液，给药前充分振荡混匀，按照5 mg·kg-1的给药剂量，灌胃给与大鼠.于灌胃前及灌胃后0.083、0.25、0.5、0.75、1、2、4、6、8、12、24和36 h从大鼠眼球静脉丛取血250 μL，置肝素化离心管中.4 500 r/min离心10 min，取上层血浆置-20 ℃冰箱中保存备用.采用DAS 2.0软件对血药浓度进行数据处理，处理后得到的主要药代动力学参数见表4.平均血药浓度-时间曲线见图4所示.