男性miR-221/222基因多态性与心力衰竭的关系

樊春红，陈晓宁

(北京大学人民医院检验科，北京 100044)

心血管疾病是人类健康的巨大威胁，特别在老年患者中，各种原因导致的心肌重塑最终均可转变为心力衰竭。而当心力衰竭出现后，其病死率显著增加。然而，由于缺乏较好的心力衰竭预测指标，常不能在心衰发生前采取有效的干预措施。因此，发现新的心衰预测标志物，对于预防心力衰竭的发生有重要意义。微小RNA(microRNA，miRNA)是一类有调控作用的非编码RNA，通常有21～23个核苷酸组成。它们通过与靶基因的3'非翻译区(3'UTR)结合而发挥其负性调控作用。近来研究发现，多种miRNA参与心肌重塑及心力衰竭的调控。已有研究发现，miR-221/222在心肌重塑动物模型过程中发挥着重要作用[1]。然而miR-221/222表达的调控及其与人心力衰竭的关系并不清楚。单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)广泛存在于基因组中。体内SNP位点的变异在多种疾病的发生、发展及治疗过程中有重要的调控作用。因此，某些有关键功能基因的SNP位点常用于相应疾病的检测及用药指导[2,3]。SNP对于miRNA的功能也有重要影响。一方面，miRNA自身编码基因出现的SNP可影响其剪切及结合；另一方面，发生在靶基因结合位点的SNP也可影响其结合作用。因此，本研究以miR-221/222为目标，分析SNP对其表达的影响，并探讨与心力衰竭的关系，旨在发现新的心衰预测指标，为本病的防治提供实验依据。

1 材料与方法

1.1研究对象:分别取自2010年至2018年在本院住院且经诊断为心力衰竭的男性患者共100例，平均年龄64.2±5.2岁；对照组为同期体检的健康男性，经年龄匹配后共入组100例，平均年龄59.5±8.7岁，经统计学分析，两组间年龄无显著性差异。

1.2样品采集:所有研究对象均采用EDTA-K2真空采血管取晨间空腹静脉血4mL。经2500转/分离心后分别分离血细胞和血浆，均冻存于-80℃冰箱备用。

1.3DNA提取、PCR扩增及测序:采用酚-氯仿-异戊醇法抽提外周血白细胞，经琼脂糖凝胶电泳鉴定合格后，采用NaNo Drop测定浓度，取部分基因组DNA，并稀释至50ng/μL用于PCR扩增反应。采用PCR法对待测部分片段进行扩增，详细信息见表1。依据表1中的信息进行PCR扩增，通过琼脂糖凝胶电泳判断扩增结果，并将PCR产物采用Sanger法测序，通过所获取的测序图分别判断SNP情况。

表1 本研究所采用的的引物序列及条件

1.4血浆miRNA提取及表达检测:将血浆样品从冰箱取出、冰上自然融化。采用mirVana血浆miR提取试剂盒(Life technologies公司)提取血浆miRNA。在提取时，每个样品中均加入线虫Cel-miR-39类似物作为内参一并提取。采用NaNoDrop对提取的RNA进行定量测定和质量鉴定，并将其稀释至5ng/μL。之后，将提取出的血浆总miRNA采用ABI公司microRNA逆转录试剂盒分别将各组样品中的miR-221、miR-222和Cel-miR-39进行逆转录。采用ABI公司的特异性TaqMan探针Real-time PCR法试剂盒检测各样品中的miR-221、miR-222及Cel-miR-39的Ct值，采用2-ΔΔCt法计算miR-221及miR-222在各组间的差异。

2 结 果

2.1miR-221/222基因簇SNP位点在心力衰竭中的分布:为探讨miR-221/222基因簇SNP位点于心力衰竭的关系，我们首先分析了该基因簇的序列特点，筛选出rs2858059、rs2858060、rs2858061、rs113054794和rs34678647共5个候选SNP位点，经测序结果见表2。

表2 miR-221/222基因簇SNP位点各基因型在心衰及对照组中分布(n)

经分析发现，上述SNP位点均符合Hardy-Weinberg平衡，其中rs2858059、rs2858060两个SNP位点存在显著连锁，且它们在两组间分布均无差异(P>0.05)。rs113054794位点在所测的200例研究对象中仅发现C/-基因型。rs34678647位点在对照组中的比例为4%，在心衰组中占10%，两组间分布无差异(P>0.05)。

2.2miR-221/222靶基因结合位点SNP在心力衰竭中的分布:p27及DDIT4为miR-221/222的已知靶基因[4,5]，其3'UTR区的SNP位点很可能影响miR-221/222的结合而调控心力衰竭。通过分析其结合序列发现，p27基因3'UTR区的rs182069485(G>T)位点以及DDIT4基因的rs72808106(A>G)位点很可能影响miR-221/222与该区域结合。然而，经过测序发现，位于p27基因的rs182069485在200例研究对象中全为G/G基因型，位于DDIT4基因的rs72808106在200例研究对象中全部为A/A基因型，两者均未检测到多态性。

2.3血浆miR-221/222水平与心力衰竭的关系:通过real-time PCR分别检测心衰患者血浆miR-221及miR-222的差异。结果发现，两者在心衰患者中均显著升高(P<0.01)，见图1。

图1 miR-221/222在心衰患者血浆中的表达

2.4miR-221/222基因多态性对血浆表达水平的影响：我们在心衰患者中，分别按照rs2858061、rs2858060(因与rs2858059连锁仅分析其中1个)和rs34678647基因型进行分组，观察血浆miR-221/222的表达强度。研究发现，rs2858061、rs2858060两个SNP位点按照各基因型分组，其患者血浆miR-221/222均无显著差异(P>0.05)。按rs34678647位点基因型分组，miR-221表达在两组间无显著差异(P>0.05)，但miR-222的表达在T/-基因型中显著高于G/-基因型，其强度分别为3.97(1.19,12.65)和0.75(0.28,3.40)。由此提示，rs34678647位点多态性很可能与心衰患者血浆miR-222的表达有关，见图2。

图2 心衰患者miR-221/222基因簇SNP位点对其表达的影响

3 讨 论

miRNA-221/222是心肌重塑的关键调控分子。前期研究以转基因动物为模型，分别研究了miR-221及miR-222对心肌重塑和心力衰竭的调控作用[1]。但其是否可作为人心力衰竭的预警标志物仍然不清楚。本研究通过SNP联合血浆miRNA表达强度的方法，分析了miR-221/222在心力衰竭中的调控状态，并发现血浆miR-221及miR-222的表达均在心衰患者中上调，且miR-222的表达可能受该基因簇SNP位点rs34678647调控。

人类miR-221/222基因簇位于X染色体，miR-221与miR-222编码基因约相距700bp左右，而其编码序列并不相同。在前期研究中也发现，心肌特异性过表达miR-221及miR-222后两者的表型并不完全相同，且miR-222过表达后心肌重塑及心衰程度更为严重。本研究发现，心衰患者血浆miR-221及miR-222均升高，提示miR-221/222很可能是心衰新的预测分子。

本研究还研究了miR-221/222基因簇的SNP位点在心衰中的关系，结果发现所研究的5个SNP位点基因型分布在心衰及对照组中均无差异，表明上述5个SNP位点可能均不能作为心衰的预测位点。但是本研究发现，rs34678647位点的T基因型可显著增强miR-222基因的表达水平，与G基因型相比，其血浆miR-222表达强度显著升高。rs34678647位点距离miR-222编码基因约186bp，而距离miR-221编码基因约为1022bp。由于该位点距离miR-222基因较近，其很可能通过影响miR-222的生成调控其在血浆中的表达水平。然而，要明确该位点对miR-222表达的影响，仍需进一步通过功能研究加以验证。

p27及DDIT4基因均为miR-221和miR-222的已知靶点[6]，且miR-221/222可通过与其靶基因3'UTR结合而调控其表达。其结合区域SNP位点的变异可显著引起其结合强度的变化而影响miR-221/222对心肌重塑和心衰的调控作用。本研究也检测了p27及DDIT4基因的两个已知SNP位点，但发现这两个SNP位点在所观察的研究对象中均无多态性。本研究也存在一定的局限性。首先，由于miR-221/222基因簇位于X染色体，本研究仅在男性人群中观察了相应的变化，并不能代表其调控在女性人群中的作用。其次，部分SNP位点如rs34678647，其T基因型所占比例较少，本结果仍需在大样本研究中进行验证。

综上所述，血浆miR-221/222在心衰男性患者中升高，其可能是新的心衰预测指标。SNP位点rs34678647可影响心衰患者血浆miR-222的表达水平，其中T基因型患者血浆miR-222表达水平显著上调，可能为心衰的预测提供一定依据。