miRNA-192-5p对多发性骨髓瘤的诊断效能及其与相关临床参数的关联性

干定云，吴 军，周 曼

(湖北省武汉市第三医院/武汉大学附属同仁医院血液内分泌科，湖北 武汉 430061)

多发性骨髓瘤约占血液系统恶性肿瘤的10%，是恶性浆细胞中常见类型，是浆细胞恶性增殖性疾病，世界卫生组织将其归为B细胞淋巴瘤的一种，其特征是骨髓中浆细胞克隆性增殖并积聚，其发病率仅次于白血病[1]。多发性骨髓瘤患者早期无明显症状，随着病情的进展临床多表现为骨痛、病理性骨折、贫血和出血、肝脾及肾脏病变等，有部分患者以骨痛为主要症状，但较易被误诊而延迟诊断[2]。多发性骨髓瘤的发病机制主要与遗传、病毒感染、基因突变、骨髓微环境的相关作用有关。随着分子生物学技术和相关化疗药物的不断完善，虽可大大延长多发性骨髓瘤患者的生存期，但该病仍不能治愈[3]。近年来有研究发现，异常表达的miRNA分子可作为抑癌基因或促癌基因调节多发性骨髓瘤细胞的增殖、迁移[4]。miRNA在体内可通过抑制靶基因对基因进行转录后调控，其在多种肿瘤的发生发展中呈现异常表达[5]，因此本研究旨在分析miRNA-192-5p对多发性骨髓瘤的诊断效能，并进一步分析与患者相关临床参数的关系，为临床治疗该病提供理论依据。

1 资料与方法

1.1研究对象：选取2016年5月至2019年5月在我院血液及肿瘤科治疗的多发性骨髓瘤患者90例为骨髓瘤组，其中男54例，女36例，年龄52～75岁，平均(60.21±3.28)岁，本研究经医院伦理委员会批准进行。入组标准：①所有患者均符合中华医学会血液病分会制定的关于多发性骨髓瘤的诊断标准[6]；②X线检查有明显的广泛性骨质疏松和溶骨性损伤；③实验室检测结果显示浆细胞>30%，且伴有形态改变；④免疫球蛋白IgG<6.0g/L，IgA<1.0g/L；⑤患者及家属知情并签署同意书。排除标准：①年龄<18岁者；②合并恶性肿瘤者、自身免疫力低下者；③患有心脑血管疾病者；④患有其他血液系统疾病者；⑤合并严重肝肾功能不全者；⑥妊娠及哺乳期妇女。另选取同期来我院行骨质疏松检查但排除多发性骨髓瘤的患者60例为对照组，男22例，女38例，年龄50～75岁，平均(59.26±3.16)岁，均排除患有恶性血液病，两组研究对象一般资料比较无统计学意义(P>0.05)。

1.2实验试剂与材料：RNA提取试剂购于ThermoFisher Scientific公司；miRNA-192-5p荧光定量PCR试剂盒购于大连TAKARA公司；miRNA-192-5pPCR引物由广州市锐博公司设计合成；乙醇、氯仿购于上海国药集团化学试剂公司；实时定量PCR仪购于美国Applied Biosystems公司；高速离心机购于美国Beckman Coulter公司。

1.3实验方法：①提取多发性骨髓瘤患者血清中总RNA：首先用无酶EP管制备400μL血清样品，将Trizol LS裂解液1000μL使样品完全覆盖，吹气搅拌均匀，15～25℃的温度下放置5min。经13500转/分的离心力在4℃温度下离心5min，取上清液置于另一EP管，按照Trizol LS和氯仿5：1的比例将200μL氯仿加入EP管中，用手剧烈摇晃15s后室温下静置5min，经13500转/分离心力在4℃温度下离心5min，取上清液置于另一EP管。将异丙醇500μL加入EP管中，倒置离心管2h。再次经13500转/分的转速在4℃下离心10min，弃上清液。将预冷的75%的乙醇1mL加入后轻轻吹气或倒置离心管，离心后弃去上清液，加入10μL DEPC水溶解，进行总RNA浓度检测，并置于-80℃冰箱保存。②采用荧光定量PCR法检测血清中miRNA-192-5p的表达变化：提取血清中总RNA后将总RNA样品、RT引物工作液及无RNA酶水进行混合，然后瞬时离心，在70℃放置10min，再次加入5μL RT Buffer5×1.25μL RNA酶抑制剂、dNTP mix、MMLV反转录酶、7.75μL无RNA酶水，在42℃逆转录反应60min，85℃逆转录反应5s，RT反应结束后将逆转录cDNA产物置于冰上冷却或放-20℃冰箱保存。配制实时定量PCR反应体系后将溶液充分混合，进行瞬时离心。在PCR板中加入制备好的20μL混合物，并为所有PCR反应设置三个平行对照。小心地将密封膜在加液完成后贴在PCR板上，并离心片刻，将PCR板放在冰上或4℃冰箱中，设定反应程序后放入上述PCR板进行PCR反应。

2 结 果

2.1两组研究对象血清中miRNA-192-5p表达情况比较：miRNA-192-5p在多发性骨髓瘤患者血清中含量为0.72±0.11，在正常对照组血清中含量为1.08±0.15，两组比较具有统计学差异(P<0.05)，见图1。

图1 两组研究对象血清中miRNA-192-5p含量比较

2.2ROC曲线分析miRNA-192-5p诊断多发性骨髓瘤的临床价值：ROC曲线分析结果显示，miRNA-192-5p诊断多发性骨髓瘤的曲线下面积为0.653，截断值为0.68，敏感性为77%，特异度为56%，P=0.023。见图2。

图2 ROC曲线分析miRNA-192-5p诊断多发性骨髓瘤的临床价值

2.3miRNA-192-5p在多发性骨髓瘤不同分期相关参数的含量比较：miRNA-192-5p的含量在β2-MG含量高的多发性骨髓瘤患者血清中明显低于β2-MG含量正常的患者(P<0.05)，miRNA-192-5p的含量在肌酐水平高的患者血清中也明显低于肌酐水平正常的患者(P<0.05)；miRNA-192-5p的含量在血红蛋白及白蛋白低下的患者血清中明显低于血红蛋白及白蛋白正常的患者(P<0.05)。见表1。

表1 miRNA-192-5p在多发性骨髓瘤相关临床参数的含量比较

2.4miRNA-192-5p与多发性骨髓瘤患者免疫球蛋白的相关性：多发性骨髓瘤患者血清中miRNA-192-5p的含量分别与IgG和IgA含量呈明显负相关(r=-0.457，-0.615，P<0.05)。见图3。

图3 miRNA-192-5p与多发性骨髓瘤患者免疫球蛋白含量的相关性

3 讨 论

多发性骨髓瘤是一种来源于免疫系统淋巴细胞的恶性肿瘤，其临床特点是恶性浆细胞无限增殖，浸润骨骼和软组织释放免疫球蛋白，导致骨溶解、贫血、肾损害等严重并发症，随着并发症的不断增加，其已成为第二常见的恶性血液病[7-8]。目前多发性骨髓瘤发病机制尚未清楚，尽管靶向药物治疗已使得多发性骨髓瘤患者预后得到了显著改善，但仍不能从根本治愈该病，且现有的预后评价指标不能反映疾病的复杂性。因此寻找及时预测多发性骨髓瘤的发病风险、监测患者的预后的肿瘤标志物，对解决临床治疗问题具有重要意义。近年来有相关资料显示，在多发性骨髓瘤发病过程中癌基因的异常激活及相关免疫调节因子的表达起着重要作用[9]。

MiRNA近年来已成为胚胎发育、肿瘤学、病毒学等多个领域的研究热点之一，具有高度的保守性及组织特异性，可通过与mRNA的3“非翻译区域的结合抑制目的mRNA，在体内代谢过程中起到多种调控作用[10]。miRNA小分子可以调控生物界50%以上的蛋白质编码和翻译，目前普遍认为其与肿瘤细胞的增殖密切相关，miRNA在白血病、淋巴瘤及乳腺癌等非血液系统肿瘤的发生发展过程中可作为抑癌基因或促癌基因起着重要作用。miRNA-192是一种进化高度保守的肝脏内富集的一类miRNA，位于人类染色体11q13，通过促进p53表达并激活其下游信号通路，起到抑制肿瘤的作用。miRNA-192可产生miRNA-192-3p和miRNA-192-5p两条成熟的链,其中miRNA-192-5p是一种多功能的调节因子，可对p53产生正向反馈作用，被认为在多种疾病的生理病理中起重要作用。有研究发现，miRNA-192-5p可通过抑制ZEB2mRNA的表达与肝癌的发病机制密切相关。本研究结果显示miRNA-192-5p在多发性骨髓瘤患者血清中表达水平为0.72±0.11，在正常对照组血清中表达水平为1.08±0.15(P<0.05)，ROC曲线分析结果显示，miRNA-192-5p诊断多发性骨髓瘤的曲线下面积为0.653，截断值为0.65，敏感性为77%，特异度为56%，P=0.023，这提示miRNA-192-5p可能在多发性骨髓瘤患者中作为抑癌基因起作用。

为进一步探讨miRNA-192-5p低表达是否能监测多发性骨髓瘤的病情进展，本研究对患者miRNA-192-5p表达量与多发性骨髓瘤临床诊断、分期等相关指标进行分析发现，miRNA-192-5p的表达水平在β2-MG、肌酐含量高的多发性骨髓瘤患者血清中明显低于β2-MG含量正常的患者(P<0.05)，miRNA-192-5p的表达水平在血红蛋白及白蛋白低下的患者血清中明显低于血红蛋白及白蛋白正常的患者(P<0.05)；多发性骨髓瘤患者血清中miRNA-192-5p的表达水平分别与IgG和IgA含量呈明显负相关(r=-0.457，-0.615，P<0.05)。这提示miRNA-192-5p的表达水平与多发性骨髓瘤的病情严重程度密切相关，其水平越低，患者预后就越差。

综上所述，miRNA-192-5p在多发性骨髓瘤患者血清中存在异常低表达，在多发性骨髓瘤的诊断中只可作为一个辅助诊断标准，其与疾病分期和预后相关指标具有一定相关性，在多发性骨髓瘤疾病进展监测中是一个较好的标志物。