放射治疗对肺癌患者外周血中DC细胞的影响

白 璐, 刘承一, 张晶晶, 高东奇, 李文鑫, 李青山

(承德医学院附属医院肿瘤科，河北 承德 067000)

放疗是恶性肿瘤的主要治疗手段之一，放疗在治疗肿瘤的过程中，通过调节机体的免疫微环境，不仅对肿瘤细胞有直接杀伤作用，还能使机体的免疫细胞被激活，促使机体的免疫细胞释放细胞因子，启动人体的免疫系统，产生旁观者效应或远位效应[1]。通过不断研究，人们逐渐开始重视放疗可以辅助机体激活免疫系统发挥重要作用[2]。本研究通过监测树突状细胞(Dendritic cell, DC细胞)数量及其存活率，探讨放疗对非小细胞肺癌受试者放疗过程中免疫功能的影响，从而为放疗联合免疫治疗选择最佳的治疗时机。

1 资料与方法

1.1研究对象:将我科2017年1月至2018年6月收治的非小细胞肺癌患者统一收集，收集患者必须经影像学或组织病理学检查，并且为不可切除的非小细胞肺癌患者，共30例。纳入标准:①经活检组织病理学或穿刺组织细胞学证实的非小细胞肺癌患者，年龄小于70岁；②放射治疗总剂量6000cGy/200cGy/30f，预计生存时间大于3个月；③患者既往未接受过放射治疗，且不能同时给予免疫治疗及化学治疗；④Karnofsky评分(卡氏评分，KPS评分)不低于70分；⑤心肝肾等脏器功能无异常；⑥血常规中白细胞、血小板及血红蛋白均在正常范围。排除标准:①放射治疗过程中需同时给予免疫治疗或化学治疗的患者；②既往给予过胸部放射治疗的患者。

1.2方 法

1.2.1治疗情况:放射治疗前要对入组患者进行基线评估包括：①明确的组织活检病理学诊断或穿刺细胞学诊断；②血常规、尿常规、便常规、生化全项、凝血七项等实验室检查；③淋巴结彩超、心电图、颈胸腹部CT等影像学检查。

1.2.2放射治疗:入组患者完善基线检查后，于CT下行放射治疗前模拟定位，应用热塑体膜固定于胸腹平架上，做好标记，然后进行CT扫描，将CT扫描的定位图像传输至放疗计划系统(Monaco系统)，在放疗计划系统中逐层勾画可见靶区及危及器官，确定放疗剂量，采用适形调强放疗(IMRT)技术进行治疗，然后由物理师制定出放疗计划，验证无误后进行治疗。我科放射治疗机器为医科达直线加速器synergy，患者每周一至周五放疗，第日1次，每次放疗剂量200cGy。总的剂量为6000cGy。

1.2.3受检血样的采集及检测方法:上述入组患者均空腹抽取血样，血样采集时间为放射治疗前1周、放射治疗2000cGy、放射治疗4000cGy、放射治疗6000cGy，标本量为静脉血5ml。主要检测指标：DC细胞计数、DC细胞凋亡数、DC细胞存活率(存活DC细胞数/总DC细胞数×100%)。

1.2.4检测方法：免疫磁珠法检测DC细胞(北京康泰合元生物技术有限公司生产的树突状细胞分离试剂盒、磁力架)

2 结 果

2.1入组患者放疗前及放疗后不同剂量时血清中DC细胞计数的变化:DC细胞数在放疗2000cGy、4000cGy、6000cGy后逐渐升高，F=8.53，P<0.001(表1和图1、5～8)。

图1 放疗前及放疗后不同时期DC细胞计数

2.2入组患者放疗前及放疗后不同剂量时血清中DC细胞存活数的变化:存活DC细胞数表现为先升高此后逐渐降低的趋势，DC细胞存活数于放疗4000cGy时升至最高，此后在放疗6000cGy时已下降，并且放疗4000cGy时的DC细胞存活数与放疗前1周、放疗6000cGy比较F=6.88，P<0.05(见表1和图2、5～8)。

图2 放疗前和放疗后不同时期活DC细胞数

2.3入组患者放疗前及放疗后不同剂量时血清中凋亡DC细胞数的变化:凋亡DC细胞数在放疗过程中未见规律性的变化，凋亡DC细胞数在放疗4000cGy时达到最高，放疗6000cGy时的DC细胞数与放疗前1周、放疗2000cGy、放疗4000cGy比较F=3.68，P=0.015(见表1和图3、5～8)。

图3 放疗前及放疗后不同时期凋亡DC细胞数

2.4入组患者放疗前及放疗后不同剂量时血清中DC细胞存活率的变化:DC细胞存活率在放射治疗前与放疗不同剂量时的差异无统计学意义，F=0.839，P=0.476(表1和图4、5～8)。

图4 放疗前及放疗后不同时期DC细胞活性

表1 不同放疗阶段DC细胞总数 活DC细胞数 凋亡DC细胞数 DC细胞活性的变化

2.5肺癌患者放疗前及放疗后不同剂量时血清中DC细胞检测分析图应用:免疫磁珠法于放射治疗前1周、放疗2000cGy、4000cGy、6000cGy检测DC细胞数的分析图。(见图5、6、7、8)

图5 放疗前1周

图6 2000cGy

图7 4000cGy

图8 6000cGy

3 讨 论

DC细胞是目前所研究出的体内功能最强大的专职抗原提呈细胞，根据其来源，可分为淋巴系统来源的DC细胞及髓系来源的DC细胞，淋巴系来源的DC细胞与NK细胞及T细胞有共同的祖细胞；髓系来源的DC细胞与单核细胞及粒细胞有共同的祖细胞。DC细胞从它的前体阶段、未成熟阶段、迁移阶段和成熟阶段逐渐发育成熟。DC细胞受到外界因素强烈刺激后即由未成熟阶段向成熟阶段转化[3]。未成熟阶段的DC细胞虽具有很强的加工及抗原捕获能力，但是其抗原提呈能力很弱；而成熟阶段的DC细胞虽加工及捕获抗原的能力降低，但有很强的抗原提呈能力。另外，DC细胞表面高表达MHC 1I类分子I-A/I-E和分泌IL-12[4,5]。MHC-II类分子位于抗原提呈细胞上，是启动免疫的主要介质。IL-12是主要的免疫因子。因此，说明DC细胞与免疫功能密切相关。一直以来，放射治疗影响机体的免疫功能主要通过对T淋巴细胞、B淋巴细胞等方面来实现，最近通过对免疫治疗的深入研究，已经发现DC作为连接固有免疫和获得性免疫的纽带，是体内最强大的抗原提呈细胞，在机体的免疫反应中起着主要的调节作用[6]，而放射治疗对DC细胞的影响无论是国内还是国外都研究甚少。近年来，国内外研究显示放疗通过促进DC细胞成熟、迁移，进而激活机体的免疫应答[7]。目前对于放疗促进DC细胞向肿瘤微环境迁移从而发挥抗肿瘤作用的研究，主要基于细胞和动物实验[8]，多给予荷瘤小鼠大分割体外照射，从而获得放射治疗对DC细胞抗肿瘤作用的促进作用，但在人体的研究未见报道。故本试验的研究对象为肺癌患者，给予常规剂量照射，收集放疗前及放疗后4个剂量点(放疗前1周、放疗2000cGy、放疗4000cGy、放疗6000cGy)的DC细胞数、存活DC细胞数、凋亡DC细胞数分别进行放疗前与放疗后比较，差异有统计学意义(P<0.05)，说明常规剂量放疗可影响DC细胞存活及凋亡；通过本研究显示DC细胞计数随着放疗剂量的增加呈逐渐增高趋势，而活DC细胞数于放疗4000cGy时最高，呈现随着一定剂量的增加而升高此后再降低的现象，故得出在放疗达4000cGy时放疗促进DC细胞的作用最强，与以往的[9]研究结果相吻合。而在放射治疗6000cGy时DC细胞数呈降低趋势，DC细胞凋亡数的变化未见明显规律性，放疗4000cGy时凋亡数最多，不除外放疗4000cGy时放疗使机体的肿瘤细胞大量坏死，坏死细胞释放多种肿瘤相关抗原，而DC细胞可发挥抗原提呈作用，从而即被消耗所致。研究显示放射治疗通过与PD-1/PD-L1联合能协同激活机体的抗肿瘤免疫应答[10]。肿瘤患者常规放疗时活DC数在放疗6000cGy时下降，故若在放疗6000cGy时给予患者免疫刺激治疗，使DC细胞数维持在较高水平，免疫促进作用，进而激活机体特异性抗肿瘤免疫应答，即可以达到DC细胞长效抗肿瘤作用，对肺癌患者的治疗起到积极的作用。通过本试验为肺癌患者放疗过程中联合免疫治疗选择最佳时机提供了一定的理论依据。研究结果显示DC细胞存活率放疗前与放疗后不同剂量点无明显统计学差异，说明放疗对DC细胞的存活率未见明显影响。

随着对抗肿瘤免疫的不断研究，放化疗与免疫治疗相结合将会给肿瘤患者带来希望，在最佳的治疗时机给予最佳的放射剂量将给患者带来最大的受益。