芳烷基苯基哌嗪类化合物NH0319 的镇痛作用及机制研究*

魏雅芹 郭 琳,2

（1 徐州医科大学药学院，徐州221004；2 徐州医科大学附属医院药学部，徐州 221006）

神经病理性疼痛 (neuropathic pain, NP) 是由躯体感觉神经系统损伤或疾病而导致的疼痛，其全球患病率为1.5%～8%，患病人数达到1 亿～5.6 亿[1]。据报道，约5%～11%的脑卒中病人，8%～10%的带状疱疹病人以及14%～26%的糖尿病病人都伴有神经病理性疼痛[2]。由于该病发病率高、疼痛剧烈且持续时间长，给病人带来极严重的身体伤害、心理负担以及巨大的经济压力，已成为当今临床医学与新药开发的热点[3]。药物是目前神经病理性疼痛的主要方法，一线用药有抗惊厥药（加巴喷丁、普瑞巴林等）和抗抑郁药（阿米替林、度洛西汀等），阿片类药物如羟考酮为二线治疗药物。这些药物临床治愈率较低，且存在较大的不良反应[4]。有研究表明，采用普瑞巴林、加巴喷丁单药或联合用药治疗196 例神经病理性疼痛病人，其总体治愈率仅为16.8%，且易出现乏力、嗜睡、头晕及水肿等不良反应[5]。而阿片类药物则易出现耐药性甚至痛觉过敏以及成瘾、呼吸抑制等不良反应。因此，开发对病理性疼痛有效、耐受性良好且作用机制新颖的非阿片类镇痛药是当今镇痛新药研发的主要目标[6]。有文献报道，激活5-HT1A自身受体和异源性受体可调控多种神经元的兴奋性及神经递质的释放，对多种疼痛，如急性、慢性、伤害性及神经病理性疼痛均表现出较好的镇痛效果[7,8]。因此，5-HT1A受体已经成为抗神经病理性疼痛新药开发的一个重要靶标，有多个药物处于临床前及临床研究阶段[9]。

本实验室前期发现了一个新型5-HT1A受体激动剂YX0611-1，在多个病理性疼痛模型中均表现出良好的镇痛作用[10～12]。但是，该化合物存在生物利用度较低 (11.4%) 和半衰期短 (1.12 h) 等缺点，不宜深入开发。为了寻找镇痛作用更强、药代特性更好的化合物，本实验室以YX0611-1 为先导化合物，对其进行了一系列结构优化和活性筛选，合成了一系列芳烷基苯基哌嗪类化合物，其中化合物9（NH0319，化学结构见图1）结构新颖，具有自主知识产权。在小鼠扭体实验及热板实验中表现出最强的镇痛活性，药代特性良好，具有开发镇痛新药的潜力[13]。本研究拟采用小鼠甩尾实验，大鼠福尔马林实验以及大鼠坐骨神经分支选择性损伤 (spared nerve injury, SNI)实验进一步考察该化合物的镇痛效果，并对其作用机制进行初步的研究，为开发新型作用机制的神经病理性疼痛新药奠定基础。

图1 NH0319 的结构Fig. 1 Structure of NH0319

方 法

1.实验动物

ICR 小鼠，雄性，18～22 g，由南京青龙山动物养殖中心提供；SD 大鼠，雄性，180～220 g，由南京青龙山动物养殖中心提供。动物饲养l 周适应环境，饲养期间保持室温20℃～25℃，相对湿度40%～70%。

2.药品与仪器

NH0319（批号20100521），由江苏恩华药业药物研究院提供，临用时用蒸馏水配成相应浓度；福尔马林（批号HN20041109），华东试剂工业公司；盐酸吗啡注射液（批号080606-1），东北制药集团沈阳第一制药；普瑞巴林（批号E05-20150601），江苏恩华药业股份有限公司产品；[3H]8-OH-DPAT，[3H]DAMGO 等同位素配体均购自于美国Perkin-Elmer 公司；5-HT，DAMGO 等非标记化合物均购自于美国Sigma 公司；YLS-12A 型鼠尾光照测痛仪，济南益延科技发展有限公司；ElectronicvonFrey 机械测痛仪，美国IITC Life Science 公司；2450-001型液体闪烁计数仪，美国Perkin Elmer 公司。

3.小鼠甩尾实验

实验时室温控制在22℃左右，辐射功率设为34 W。将ICR 小鼠放入小鼠固定器中，暴露尾部用于光幅照。幅照部位固定在每只小鼠尾部的中、下1/3 处，稍待小鼠安静后即可进行致痛实验。记录从照射开始到出现甩尾反应的潜伏期，作为其痛阈值。所有小鼠在给药前先测2 次基础痛阈值，基础痛阈3～6 s 为合格，淘汰不合格的小鼠。将合格小鼠按体重均衡分为5 组，分别为溶媒组、吗啡组(5 mg/kg)、NH0319 低剂量组(20 mg/kg)、中剂量组(40 mg/kg)及高剂量组(80 mg/kg)，每组12 只。溶媒组及NH0319 给药组采用灌胃给药，1 h 后进行痛阈值的测定。吗啡组皮下注射给药，30 min 后测定痛阈值。各组小鼠给药后均进行2 次痛阈值的测定，每次间隔5 min，取平均值作为给药后的痛阈值。为保护小鼠尾巴不受伤害，超过10 s不甩尾者记为10 s。

4.大鼠福尔马林疼痛实验

SD 大鼠，按体重均衡分为5 组，分别为溶媒组、吗啡组(5 mg/kg)、NH0319 低剂量组(20 mg/kg)、中剂量组(40 mg/kg)及高剂量组(80 mg/kg)，除溶媒对照组13 只大鼠外，其余各组每组10 只大鼠。NH0319 各给药组灌胃相应剂量的药物，吗啡组皮下注射吗啡，溶媒组灌胃等体积的双蒸水(10 ml/kg)。NH0319 各给药组及溶媒组大鼠灌胃给药后60 min，吗啡组皮下给药后30 min 进行福尔马林注射，每只大鼠右后肢3、4 趾间皮下注射5% 的福尔马林，每只注射50 μl，以形成皮丘为造模型成功标准。注射福尔马林后，立即把大鼠放入观察盒中进行观察。每只大鼠观察1 h，用秒表记录大鼠1 h 内I 相(0～5 min)及II 相（15～60 min）缩腿舔足时间。

5.大鼠坐骨神经分支选择性损伤(spared nerve injury, SNI)实验

（1）实验设计、分组及给药：大鼠术前先测定机械痛阈值 (mechanical withdrawal threshold, MWT)，连续测量2 天，取其平均值作为基础MWT，随后进行SNI 手术。术后第13 天再次测定MWT，以判断是否造模型成功，术后MWT 相比基础MWT 下降40%以上为造模成功的标准，淘汰造模不成功的大鼠。造模成功的大鼠按MWT 值均衡分组，分别为溶媒组、普瑞巴林组(40 mg/kg,i.g.)、NH0319 低剂量组(20 mg/kg,i.g.)、中剂量组(40 mg/kg,i.g.)及高剂量组(80 mg/kg,i.g.)。溶媒组10 只大鼠，其余各组每组8 只大鼠。手术后第14、15、16 及17 天灌胃给药，每天1 次。分别测定术后第14 天及第17 天给药后1 h 的MWT，用于评价NH0319 单次给药及多次给药的镇痛药效。

（2）SNI 模型的制备：采用10% 水合氯醛(350 mg/kg)麻醉大鼠，切开后肢侧面皮肤，钝性分离股二头肌，暴露坐骨神经及其3 个分支：胫神经、腓总神经和腓肠神经。分别双重结扎胫神经、腓总神经，在双重结扎的中央切断，并分别去除末端2～4 mm 的神经干。术中避免接触或牵拉腓肠神经，保持其完整。术后分层缝合伤口，抗生素抗炎。

（3）机械痛阈值测量：大鼠置于透明的有机玻璃箱 (22 cm×12 cm×22 cm) 中，底为0.5 cm×0.5 cm 孔径的金属网格机械性痛觉测试架。实验前适应环境30 min。用ElectronicvonFrey 痛觉测量仪垂直刺激术侧后肢足底中部，缓慢施加力度，直到大鼠抬足或舔足，此力度为MWT，测定4 次，为避免或减少前一次刺激对随后刺激效应造成的影响，同一部位测量时间至少间隔3 min，取4 次平均值作为MWT 值。

6.放射性配体受体结合实验

为了研究化合物NH0319 的镇痛作用靶点，选取中枢神经系统中与镇痛药效或不良反应相关的21 个受体进行了放射性配体受体结合实验，这些受体包括阿片类 (mu、kappa、delta) 受体，5-羟色胺 (5-HT1A、5-HT1B、2-HT2A、2-HT2C) 受体，多巴胺 (D1、D2、D3) 受体，肾上腺素 (α1、α2) 受体，组胺 (H1、H3)受体，Sigma (Sigma-1、Sigma-2) 受体，单胺类转运体(SET、NET、DAT)，N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体以及γ-氨基丁酸A 型 (GABAA) 受体等。放射性配体受体结合实验方法参照国立精神卫生研究院精神活性药物筛选程序 (national institute of mental health's psychoactive drug screening program, NIMH-PDSP)进行[14]，[3H]8-OH-DPAT, [3H]DAMGO等同位素配体均购自于美国 PerkinElmer 公司；5-HT, DAMGO 等非标记化合物均购自于美国Sigma 公司。详细的实验条件见表1。实验分为两步，首先进行单浓度亲和力实验，NH0319 的浓度设置为10 μM，当NH0319 在此高浓度下对受体的抑制率小于50%时，说明化合物不作用于该受体。当抑制率大于50%时，说明与受体可能具有一定的亲和力，需进行进一步的剂量/效应实验，得到IC50值，以进一步确定化合物与受体的亲和力大小。实验时NH0319 设置6 个浓度，分别为0.1、1、10、100、1000 及10 000 nM，得到各个浓度的抑制率，计算出IC50值。

7.统计学分析

结 果

1. NH0319 明显延长甩尾实验中小鼠甩尾潜伏期

经初筛淘汰掉痛阈值较小及较大的小鼠后，各实验组小鼠给药前甩尾潜伏期介于3.40～4.19 s 之间，各组之间基础痛阈值没有明显差异 [F(4,55)= 1.72,P＞ 0.05]，但给药后各组痛阈值具有显著性差异 [F(4,55)= 6.55,P＜ 0.01]。吗啡组小鼠甩尾潜伏期明显高于溶媒组(P＜ 0.01)，表现出明显的镇痛作用。化合物NH0319 中剂量和高剂量组小鼠的甩尾潜伏期也明显高于溶媒组(P＜ 0.05,P＜ 0.01)，提示化合物NH0319 具有潜在的镇痛效应，实验结果见表2。

2. NH0319 明显缩短福尔马林诱导的大鼠缩腿舔足时间

实验结果见表3 所示，在I 相疼痛测试中，各试验组大鼠缩腿舔足时间具有显著性差异 [F(4,48)= 5.28,P＜ 0.01]。进一步分析显示，吗啡组、NH0319 中剂量组(40 mg/kg)、高(80 mg/kg)剂量组I 相缩腿舔

足时间明显低于溶媒处理组(P＜ 0.01,P＜ 0.05)，说明NH0319 对足底注射福尔马林导致的急性疼痛有较好的镇痛作用。在II 相疼痛测试中，各组大鼠的缩腿舔足时间也具有显著性差异(F(4,48)= 10.43,P＜ 0.01)。其中，吗啡组、NH0319 中(40 mg/kg)、高(80 mg/kg)剂量组缩腿舔足时间与溶媒组相比有统计学意义(P＜ 0.01)，说明NH0319 对足底注射福尔马林导致的持续性疼痛也有较好的镇痛效果。

表1 NH0319 放射性配体受体亲和力实验条件Table 1 Experimental conditions for radioligand receptor binding assay of NH0319

表2 NH0319 对甩尾试验中小鼠甩尾潜伏期的影响(n = 12, ±SD)Table 2 Effect of NH0319 on the tail flick latency in the tail flick test in mice (n = 12, ±SD)

表2 NH0319 对甩尾试验中小鼠甩尾潜伏期的影响(n = 12, ±SD)Table 2 Effect of NH0319 on the tail flick latency in the tail flick test in mice (n = 12, ±SD)

*P ＜ 0.05, **P ＜ 0.01，与溶媒组相比；*P ＜ 0.05, **P ＜ 0.01, compared with group vehicle.

给药后痛阈值 (s)Pain threshold after administration (s)溶媒组Vehicle group - 4.19±1.14 4.22±1.37吗啡组Morphine group 5 3.85±0.76 7.31±2.11**NH0319 低剂量组NH0319 low dose group 20 3.40±0.58 5.23±1.48 NH0319 中剂量组NH0319 middle dose group 40 3.66±0.75 5.78±1.11*NH0319 高剂量组NH0319 high dose group 80 3.62±0.57 6.52±1.78**组别Group剂量 (mg/kg)Dose (mg/kg)基础痛阈值 (s) Baseline pain threshold (s)

表3 NH0319 对福尔马林实验中大鼠缩腿舔足时间的影响(n = 10～13, ±SD)Table 3 Effect of NH0319 on the time of paw withdrawal and paw licking in formalin test in rats (n = 10-13, ±SD)

*P ＜ 0.05, **P ＜ 0.01，与溶媒组相比；*P ＜ 0.05, **P ＜ 0.01, compared with group vehicle.

缩腿舔足时间 (s)The time of paw withdrawal and paw licking (s)I 相Phase I II 相Phase II溶媒组Vehicle group - 13 223.8±44.6 2312.5±348.5吗啡组Morphine group 5 10 129.0±22.2** 924.5±799.4**NH0319 低剂量组NH0319 low dose group 20 10 241.1±37.1 1886.6±800.1 NH0319 中剂量组NH0319 middle dose group 40 10 152.6±110.3* 952.1±838.9**NH0319 高剂量组NH0319 high dose group 80 10 164.1±88.8* 895.7±631.5**组别Group剂量 (mg/kg)Dose (mg/kg)动物数Number

3. NH0319 明显提高SNI 模型大鼠MWT 值

动物接受SNI 手术后逐渐出现明显跛行、术侧后爪外翻等疼痛表现，并进行性加重。术后第13 天测量MWT，淘汰造模不成功的大鼠。造模成功的大鼠按MWT 均衡分组，各组大鼠给药前基础MWT 介于28.07～29.68 g 之间，组间无明显差别 [F(4,37)= 0.17,P＞ 0.05]。大鼠术后14～17天连续给药，测定14 天及17 天给药后1 h 大鼠的MWT，用于评价药物单次给药及多次给药的药效。结果表明，单次给药及多次给药后各组大鼠间的MWT 均出现显著性差异 [F(4,37)= 2.76,P＜ 0.05]及 [F(4,37)=12.37,P＜ 0.01]，说明药物对模型动物的疼痛行为进行了有效的干预。其中，与溶媒组相比，普瑞巴林40 mg/kg组单次给药时对大鼠的MWT 无明显影响(P＞ 0.05)，但多次给药后能明显提高大鼠的MWT (P＜ 0.01)，说明普瑞巴林需要多次给药才能发挥明显的镇痛药效。而NH0319 中(40 mg/kg)、高(80 mg/kg)剂量组单次及连续4 天给药后均能明显提高大鼠的MWT (P＜ 0.05,P＜ 0.01)，对神经病理性疼痛动物模型表现出良好的镇痛作用且能较快发挥药效，实验结果见表4。

4. NH0319 选择性作用于5-HT1A 受体

采用放射性配体受体结合实验对NH0319 镇痛作用靶点进行初步探讨。本次实验一共进行了中枢神经系统中与镇痛药效或不良反应相关的21 个受体的亲和力实验。实验结果表明，在10 μM 的实验浓度下，NH0319 对5-HT1A受体的抑制率达到99%，说明该化合物对这个受体具有较强的亲和力；对5-HT2A受体、5-HT2C受体及DAT 受体的抑制率大于50%，分别为63%、50%及65%，说明NH0319 对这三个受体可能有一定的亲和力。此外，NH0319 对其余的受体抑制率均较低(＜ 50%)，说明NH0319 对这些受体没有明显的亲和力。针对5-HT1A受体、5-HT2A受体、5-HT2C受体及DAT 受体的进一步亲和力浓度-效应关系实验结果表明，NH0319对5-HT1A受体亲和力IC50值为15.05±3.28 nM，对其余三个受体的IC50值均大于1000 nM，说明NH0319 只对5-HT1A受体有较强的亲和力，是一个选择性作用于5-HT1A受体的非阿片类镇痛化合物，实验结果见表5。

讨 论

小鼠甩尾实验及大鼠福尔马林实验是两个经典的疼痛动物模型，由于操作简单，能快速出实验结果，常用于新化合物镇痛活性的早期筛选。本实验首先采用这两个模型来评价化合物NH0319 的镇痛活性。结果表明，NH0319 中(40 mg/kg)、高(80 mg/kg)剂量给药时能明显延长甩尾实验中小鼠甩尾潜伏期，减少福尔马林实验中大鼠I、II 相缩腿舔足的时间，说明该化合物具有良好的镇痛作用。接下来建立了大鼠SNI 模型以进一步考察该化合物是否具有抗神经病理性疼痛的药效，并与普瑞巴林进行对照。结果表明，神经病理性疼痛一线治疗药物普瑞巴林只有多次给药时能明显的提高大鼠MWT，单次给药时没有表现出明显镇痛效果。而NH0319 单次及多次给药均能明显提高大鼠MWT，表现出较好的抗神经病理性疼痛的药效。NH0319 镇痛效果与普瑞巴林相当，但起效更快。

表4 NH0319 对SNI 模型大鼠机械痛阈值的影响(n = 8～10, ±SD)Table 4 Effect of NH0319 on MWT in SNI model rats (n = 8-10, ±SD)

表4 NH0319 对SNI 模型大鼠机械痛阈值的影响(n = 8～10, ±SD)Table 4 Effect of NH0319 on MWT in SNI model rats (n = 8-10, ±SD)

*P ＜ 0.05, **P ＜ 0.01，与溶媒组相比；*P ＜ 0.05, **P ＜ 0.01, compared with group vehicle.

组别Group剂量(mg/kg)Dose (mg/kg)机械痛阈值(g) MWT (g)给药前Before dose多次给药后After multiple doses溶媒组Vehicle group - 29.68±4.29 30.85±4.78 28.73±3.77普瑞巴林组Pregabalin group 40 28.45±5.33 34.09±5.38 40.61±7.92**NH0319 低剂量组NH0319 low dose group 20 28.07±4.51 32.83±6.91 31.93±2.68 NH0319 中剂量组NH0319 middle dose group 40 28.65±4.76 37.60±2.56 38.65±4.68**NH0319 高剂量组NH0319 high dose group 80 28.33±3.99 38.42±7.62* 42.10±4.05**单次给药后After single dose

表5 NH0319 对中枢神经系统疼痛相关受体亲和力实验研究Table 5 Binding affinities of NH0319 for pain related receptors in the central nervous system

5-HT1A受体可分为自身受体及异源性受体。5-HT1A自身受体分布于5-HT 神经元的胞体和树突上，位于中缝核和5-HT 释放的终末部位[15]。5-HT1A异源受体分布于非5-HT 能神经元（如谷氨酸能神经元，GABA 能神经元，胆碱能神经元等）的突触后膜，可调节这些神经元的兴奋性及相关递质的释放[16]。有文献报道，中枢5-HT 能神经系统及5-HT1A受体参与了疼痛信号的调节，是潜在的镇痛药物靶标[9]。F-13640 是一个强效的5-HT1A受体激动剂，在急性、慢性、伤害性及病理性疼痛动物模型均表现出较好的镇痛效果[17～20]。Franchini 等报道了一类1, 3-二恶烷基2-异芳基-苯氧基乙基胺衍生物，对5-HT1A受体有很强的激动作用，在神经保护及神经病理性疼痛治疗上可能会有较好的效果[21]。另有专利报道了一类芳基- [4-卤代-4（氨基甲基）哌啶-1-基]-甲酮类衍生物，对5-HT1A受体有较强亲和力(pKi = 8-10)。其代表性化合物1A1 对福尔马林疼痛(ED50= 0.05 mg/kg)及奥沙利铂诱导的病理性疼痛（有效剂量0.04 mg/kg）均有明显的镇痛作用[22]。放射性配体受体结合实验表明，NH0319 除与5-HT1A受体有较强的亲和力以外(IC50= 15.05±3.28 nM)，对中枢神经系统中包括阿片类受体（阿片mu 受体、阿片kappa 受体、阿片delta 受体）在内的其它20个受体都没有明显的亲和力(IC50＞ 1000 nM)，说明该化合物是一个选择性作用于5-HT1A受体的非阿片类镇痛药，很可能通过作用于5-HT1A受体，调节神经元兴奋性及递质释放而发挥镇痛作用。

综上所述，化合物NH0319 对小鼠甩尾实验、大鼠福尔马林致痛实验以及大鼠SNI 实验都有较好的镇痛效果，其镇痛机制可能与其作用于5-HT1A受体，调节神经元兴奋性及递质释放有关，有望开发成新型的非阿片类抗神经病理性疼痛新药。