结肠癌组织中miR-21、C-met的表达及临床意义

刘杰 张文天 杜锦波

[摘要] 目的 探究结肠癌组织中微小RNA（miR）-21和肝细胞生长因子受体（C-met）的表达情况及临床意义。方法 回顾性分析2017年2月～2019年5月河北省沧州市人民医院收治的95例结肠癌患者的病理及临床资料。通过荧光实时定量PCR技术定量检测miR-21和C-met在结肠癌组织及其癌旁正常组织中的表达量并比较分析其与临床病理的联系，分析癌组织中miR-21和C-met的相关性。 结果 结肠癌组织中miR-21和C-met的表达量均高于对应癌旁正常组织（P < 0.05）。结肠癌组织中miR-21和C-met的表达与TNM分期、淋巴结转移及脉管癌栓有关（P < 0.05）。结肠癌组织中miR-21的表达量和C-met的表达量呈显著正相关（r = 0.832，P = 0.000）。 结论 结肠癌组织中C-met和miR-21的表达均上调，且与TNM分期、淋巴结转移及脉管癌栓有关，二者均可能成为评估病情严重程度及预后情况的潜在标志物。

[关键词] 结肠癌;微小RNA-21;肝细胞生长因子受体;相关性

[中图分类号] R735          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2020）06（b）-0121-04

Expression and clinical significance of miR-21 and C-met in colon cancer

LIU Jie   ZHANG Wentian   DU Jinbo

Department of Gastrointestinal Surgery， Cangzhou People′s Hospital， Hebei Province， Cangzhou   061000， China

[Abstract] Objective To investigate the expression and clinical significance of microRNA（miR）-21 and hepatocyte growth factor receptor（C-met） in colon cancer tissues. Methods The pathological and clinical data of 95 cases with colon cancer who admitted to Cangzhou People′s Hospital of Hebei Province from February 2017 to May 2019 were analyzed retrospectively. Quantitative real-time PCR was used to quantitatively detect the expression levels of miR-21 and C-met in colon cancer tissues and adjacent normal tissues， and their correlation with clinicopathology were analyzed， and the correlation between miR-21 and C-met in cancer tissues was analyzed. Results The expressions of miR-21 and C-met in colon cancer tissues were higher than those in adjacent normal tissues （P < 0.05）. The expressions of miR-21 and C-met in colon cancer tissues were related to TNM stage， lymph node metastasis and vascular cancer embolus （P < 0.05）. There was a significant positive correlation between miR-21 expression and C-met expression in colon cancer tissues （r = 0.832， P = 0.000 ）. Conclusion The expressions of C-met and miR-21 in colon cancer tissues are both up-regulated， and are associated with TNM stage， lymph node metastasis and vascular cancer embolus， which may be potential markers for assessing the severity of the disease and prognosis.

[Key words] Colon cancer; MicroRNA-21; Hepatocyte growth factor receptor; Correlation

結肠癌是常见的肠道恶性肿瘤，其在发展中国家的发病率逐年增加，严重危害人们的生活质量及生命安全。由于结肠癌早期症状不明显，多数患者确诊时肿瘤已进展到中晚期[1]，因此深入探寻结肠癌发生和进展机制，明确癌变过程中的关键靶点对早期诊断和靶向药物研发意义重大。微小RNA（miRNA）是一种内源性非编码RNA，能够调控基因转录后表达、组织分化以及细胞周期等生命活动[2]。miR-21位于染色体17q23.1，其作用类似于原癌基因，通过参与调控细胞周期和基因表达等过程促进恶性肿瘤进展[3]。相关研究报道[4]，miR-21能够抑制细胞凋亡和调控Ras/MEK/ERK途径，进而促进癌症的发生与进展。肝细胞生长因子受体（C-met）是由原癌基因编码生成的跨膜蛋白，能够调控细胞骨架重排及信息传导途径，在癌细胞增殖、分化、浸润及转移过程中发挥重要作用[5]。既往研究显示[6]，C-met蛋白可激活酪氨酸激酶，进而影响信号传导通路及其酶促反应，与多种癌基因产物关系密切，在肿瘤细胞中异常表达。本研究探讨miR-21和C-met在结肠癌组织中的表达量及临床意义，同时分析二者的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料

回顾性分析2017年2月～2019年5月河北省沧州市人民医院收治的95例结肠癌患者的病理及临床资料。纳入标准：①符合《结肠癌规范化诊疗指南（试行）》[7]标准且结肠镜及术后病理诊断为结肠癌;②患者临床资料齐全，且自愿配合本研究;③均为首次诊断，且既往无放化疗史和肠道手术史。排除标准：①合并肠道恶性肿瘤或严重疾病者;②伴有肝肾功能严重下降而不宜手术者;③患有先天遗传性疾病或免疫系统异常者。

本研究共纳入研究对象95例，其中男51例，女44例;平均年龄（57.34±9.61）岁;有淋巴结转移者14例，无淋巴结转移者81例;肿瘤直径≤5 cm者47例，肿瘤直径>5 cm者48例;高分化者65例，中分化者23例，低分化者7例;TNMⅠ期31例，Ⅱ期44例，Ⅲ期15例，Ⅳ期5例;有脉管癌栓者16例，无脉管癌栓者79例;有远处转移者19例，无远处转移者76例。

1.2 方法

miR-21和C-met的表达量采用荧光实时定量PCR技术（qRT-PCR）进行检测。术中分别取结肠癌组织和对应癌旁正常结肠组织（距病灶10 cm处），统一暂存于液氮中，术后立即转存于-80℃冰箱中。肿瘤直径通过卡尺测得。两种组织均取100 mg，研磨后均加入1 mL Trizol试剂（购自Invitrogen公司，生产批号：20161001）提取总RNA。将20 μg总RNA通过ImProm-ⅡTM Reverse Transcriptase（购自Promega 公司，生产批号：20170122）反转录为cDNA。miR-21和C-met的表达量通过SYBR ExTaq Mix试剂盒（购自TaKaRa 公司，生产批号：20161213）定量检测。miR-21和C-met的反应条件均为42℃ 60 min，70℃ 15 min。二者PCR反应体系为10 μL SYBR ExTaq Mix、0.4 μL PCR Forward Primer、0.4 μL PCR Reverse Primer、0.4 μL ROX Reference DyeⅡ、2.0 μL cDNA template以及6.8 μL RNase free dH2O，共计20 μL。miR-21上游引物序列为5′-ACACTCCAGCTGGGTAGCTTATCAGA-CTGA-3′、下游引物序列为5′-TGGTGCGTGGAGTC-G-3′，内参基因U6的正向引物序列为5′-CTCGCTT-CGGCAGCACA-3′、反向引物序列为5′-AACGCTTA-CGAATTTGCGT-3′;C-met正向引物序列为5′-GAGGCAGTGCAGCATGTAGT-3′、反向引物序列为5′-G-ATGATTCCCTCGGTCAGAA-3′，内参基因GAPDH正向引物序列为5′-TCAGTGGTGGACCTGACCTG-3′、反向引物序列为5′-TGCTGTAGCCAAATTCGTTG-3′。C-met的PCR反应条件为95℃ 5 min，变性95℃ 10 s，退火60℃ 30 s，延伸72℃ 30 s;而miR-21的PCR反应条件为95℃ 10 min，变性95℃ 15 s，退火及延伸60℃ 60 s，二者均为40个循环，每个样本均进行3次检测。所有引物均由上海生工公司负责合成。所有样品均用相对Ct值法评估，结果以ΔCt值表示，miR-21和C-met的表达量分别相对于U6和GAPDH的比值为2-ΔΔCt，其中ΔCt=Ct目的基因-Ct内参基因。

1.3 统计学方法

采用SPSS 22.0统计学软件进行数据分析，计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用t检验;相关性检验用Pearson相关分析。以P < 0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 结肠癌组织及其对应癌旁正常组织中miR-21和C-met的表达量比较

结肠癌组织miR-21和C-met表达量均高于对应癌旁正常组织（均P < 0.05）。见表1。

2.2 结肠癌组织中miR-21和C-met的表达量与临床病理的关系

结肠癌组织中miR-21和C-met的表达量与TNM分期、淋巴结转移及脉管癌栓有关（P < 0.05），与患者性别、年龄、肿瘤大小及分化程度无关（P > 0.05）。见表2。

2.3 结肠癌组织中miR-21和C-met表达的相关性分析

结肠癌组织中miR-21的表达量和C-met的表达量呈显著正相关（r = 0.832，P = 0.000）。见图1。

3 讨论

结肠癌屬于高度恶性的肠道肿瘤，其发病率在恶性肿瘤中居第三位，而死亡率居第二位，对人类健康造成巨大威胁[8]。近年来，由于生活方式和饮食结构的改变，结肠癌的发病率仍不断提高，且呈显著地域性差异[9]。结肠癌的发病是一个复杂且漫长的过程，是多因素、多阶段及多基因共同作用的结果，其中以抑癌基因失活和原癌基因激活尤为关键[10]。目前，临床主要采用手术为主、化疗为辅的治疗方式，但由于结肠癌毗邻器官较多、周围血供和淋巴系统丰富，易于远处转移和侵犯周围器官，因此疗效较差，患者复发率和死亡率较高。表观遗传学是结肠癌近年来研究的热点，有望为结肠癌的早期诊断、预防以及评估预后提供有力证据。既往研究显示[11-12]，DNA甲基化、非编码RNA、组蛋白修饰以及DNA磷酸化均在肿瘤易感性及进展中发挥重要作用，使环境介导基因表型改变，进而造成基因表达多样性，最终提高正常细胞演变为癌细胞的风险。

miRNA是高度保守的非编码RNA，主要位于内含子或基因间隔区，其表达具有组织和时序特异性。研究显示[14]，miR-21具有致癌作用，在肺癌、乳腺癌等恶性肿瘤中表达上调。此外，miR-21通过作用其靶点PDCD4和抑制凋亡蛋白2，促进结肠癌细胞不断增殖、分化及侵袭，同时，也有助于提高癌细胞的耐药性[14]。本研究结果显示，结肠癌组织中miR-21的表达量高于对应癌旁组织（P < 0.05），其机制可能为长链非编码RNA（LncRNA）MEG3能够负性调控miR-21的表达有关。在正常细胞中，LncRNA MEG3自身可以作为分子海绵，通过结合miR-21抑制其表达，然而在肿瘤细胞中LncRNA MEG3表达下调，使抑制miR-21的作用减弱，从而使miR-21上调[15]。结肠癌组织中miR-21的表达与TNM分期、淋巴结转移及脉管癌栓有关（P < 0.05），且恶性度越高，miR-21表达量越高。其机制可能为癌组织中的miR-21激活PI3K/AKT信号通路，促进癌细胞增殖，抑制其凋亡，调节病灶周围炎性反应，同时诱导正常细胞发生上皮间质转化，降低E-钙黏素，使其分化程度降低并促进转移[16]。miR-21能够抑制BTG2、NEDD4L以及PDCD4等抑癌基因发挥作用，且促进原癌基因表达，从而刺激癌细胞分化和增殖[14]。此外，miR-21能够诱导侵袭因子基质金属蛋白酶（MMP）-2和MMP-9的表达，增强癌细胞的侵袭和迁移能力，使肿瘤的恶性度增加[16]。

C-met又称肝细胞生长因子受体，位于细胞膜骨架上，包含两种亚基（α和β）和一个酪氨酸激酶区，具有酪氨酸激酶活性[17]。C-met通过结合肝细胞生长因子（HGF）使自身磷酸化，进而诱导其他底物蛋白磷酸化，激活3-磷脂酰肌醇激酶途径和有丝分裂原活化蛋白激酶途径，使HGF活化，促进肿瘤细胞无限增殖及分化[18]。本研究结果显示，结肠癌组织中C-met的表达量高于对应癌旁正常组织（P < 0.05）。其机制可能为癌组织中过度表达的HGF结合C-met，激活酪氨酸激酶，使其催化结构域内的酪氨酸酶（Tyr）1234和Tyr1235发生磷酸化反应，进而增加C-met的生物活性，使C-met表达提高[19]。本研究结果显示，结肠癌组织中C-met的表达与TNM分期、淋巴结转移及脉管癌栓有关（P < 0.05），且恶性度越高，C-met表达量越高。其原因可能是活化的C-met能够激活黏附分子并重排细胞骨架结构，同时，MMP被激活，从而降解部分细胞外基质，促进癌细胞向周围组织的浸润和转移[20-21]。同时，C-met通过自体磷酸化促进磷脂酶、Ras蛋白以及接头蛋白Gab1等蛋白的酪氨酸磷酸化，逐步形成级联化的磷酸化反应，将放大的信号转导入细胞核的转录系统，从而使癌细胞增殖和分化能力增强[17]。

本研究结果显示，癌组织中的C-met表达量和miR-21表达量呈显著正相关（P < 0.05），提示C-met和miR-21可能都具有促进癌症进展的功能，且miR-21可能与C-met互为协同作用，共同加速结肠癌的发生及进展。尽管目前无研究显示二者作用的具体机制，但C-met和miR-21均可作用于RAS/ERK信号通路，增强癌细胞的活性，促进肿瘤进展，间接反映了二者可能通过该信号通路起到互相协同的作用[4，17]。然而，本研究样本量有限，C-met和miR-21之间的作用机制仍不明确，需要进一步探索。

综上所述，结肠癌组织中C-met和miR-21的表达均上调，且与TNM分期、淋巴结转移及脉管癌栓有关，可能是评估病情严重程度及预后情况的潜在标志物。

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（收稿日期：2019-11-13  本文编辑：刘明玉）