结节性硬化症5家系临床及基因突变分析

李 敏 张继要 董 伟 赵亚梅 罗 强

郑州大学第一附属医院儿科（河南郑州 450000）

结节性硬化症（tuberous sclerosis complex，TSC）是一种由外胚层组织和器官发育异常导致的遗传性疾病，可累及全身多个系统和器官，引起皮肤、脑、肾脏等器官病变。其遗传学特征为常染色体显性遗传，但自发突变率高，家族遗传约占30%～40%，散发病例则可达60%～70%。目前已知致病变异基因为TSC1和TSC 2[1]。2012年最新TSC诊断共识提出将组织中TSC 1或TSC 2基因变异作为TSC的一项独立诊断标准[2]，凸显基因检测在TSC诊断中的价值。TSC临床表现个体差异大，基因变异多样，外显率不一，无热点突变，目前尚不能根据患儿基因型准确推断其临床表型。本研究通过分析5个家系患者的临床表现及基因检测结果，以丰富TSC基因变异谱，并寻找TSC基因变异规律，进一步明确临床表型与基因型的关系，有助于早期识别TSC。

1 临床资料

5个家系之间无血缘关系，患儿父母均非近亲结婚，来自郑州大学第一附属医院儿科住院部及门诊。

先证者1，男，3月龄。出生时腹、腰部及手臂各见一色素脱失斑，直径最大约6 mm，1月龄开始出现抽搐，表现为痉挛性发作。体格检查：追视、追听尚可，抬头不稳，无明显发育落后。脑电图提示两侧额、中央、顶、枕、颞区可见痫性波发放；头颅CT检查可见右侧颞叶片状高密度影。患儿母亲躯干可见色素脱失斑，两个姨母均有癫痫病史。

先证者2，女，3岁。1年余前出现间断抽搐，表现为局灶性发作性继发全面强直-阵挛发作，曾口服丙戊酸镁缓释片、奥卡西平，但控制欠佳。患儿3月龄会抬头，8月龄会坐，1岁3月龄会走，智力发育稍落后于同龄人。体格检查：鼻翼两侧散在血管纤维瘤，左侧背部分别可见直径3 mm、5 mm皮肤色素脱失斑。动态脑电图提示发作期全导可见异常痫性波发放；头颅CT示皮质下多发钙化灶。患儿父母体健，无类似疾病家族史。

先证者3，男，4月龄。3月龄时以局灶性癫痫发作起病，发作频繁，约十余次/天，未出现智力落后情况。入院检查血氨、乳酸、同型半胱氨酸、肝肾功能无异常；动态脑电图示两侧额、中央、顶、枕、颞区可见痫性波发放；头颅CT检查未见钙化灶。患儿父母及姐姐体健，无类似疾病家族史。

先证者4，男，10月龄。出生20余天发现颜面、胸、腹、背部散在片状色素脱失斑，最大约15 mm；3月龄时出现癫痫性痉挛发作，逐渐出现语言、运动、智力发育落后，8月龄会坐，现不能扶站，不会认人。视频脑电图监测到临床痉挛性发作，伴高波幅爆发低电压抑制；颅脑CT示左侧半卵圆中心、双侧基底节区、双侧侧脑室下多发钙化灶；心脏彩超提示左室假腱索。患儿母亲全身散在色素脱失斑，左侧颈部散在血管纤维瘤，28岁时行肾脏占位手术（具体不详）；患儿哥哥2岁时出现癫痫，面部可见散在血管纤维瘤，口服抗癫痫药物治疗控制可，现9岁，智力落后；患儿姐姐及父亲体健。

先证者5，女，2岁。生后四肢即可见色素脱失斑，2月龄时家属觉患儿面部表情呆滞，5月龄时面部出现散在血管纤维瘤，8月龄时以癫痫性痉挛发作起病，现智力、运动发育落后。头颅CT示脑室管膜下可见多发钙化灶。患儿母亲10余岁时出现癫痫，口服抗癫痫药物（具体不详）后未再发作，现可见面部血管纤维瘤；哥哥可见面部血管纤维瘤；父亲体健。

为进一步明确诊断，经医院伦理委员会同意，患儿及其家属签署知情同意书后对家系1、5先证者及其家系成员进行全外显子测序，家系2、3、4先证者行癫痫及相关疾病基因检测，所有具有临床意义的变异采用Sanger测序进行验证。先证者1的TSC 1基因存在c.2074 C＞T杂合无义变异，2074位碱基由胞嘧啶（C）改变为胸腺嘧（T），TSC1蛋白692号密码子由精氨酸替换为终止密码子，为自发变异（图1）。先证者2及其父亲的TSC 2基因存在c.2545+10 C＞T杂合变异，编码区第2545号核苷酸后内含子中第 10位核苷酸由C变为T，为剪切变异（图2）。先证者3及其母亲、姐姐的TSC1基因存在c.2497C＞T杂合无义变异，导致编译第833号氨基酸Gln的密码子变为终止密码子（图3）。先证者4及其母亲、姐姐、哥哥的TSC 2基因存在c.4375C＞T杂合无义变异，导致编译第1459号氨基酸Arg的密码子变为终止密码子（图4），其致病性尚未见文献报道。先证者5未发现异常变异。家系1、3的TSC1变异为无义变异，使蛋白质截断，均为已报道的致病性变异；家系2、4分别为剪切变异、无义变异，检索人类基因突变数据库（human gene mutation datebase，HGMD），其致病性尚未见文献报道，经Mutation Taster蛋白功能软件预测，c.4375C＞T为很可能致病（disease-causing-automatic），ACMG评级为致病；c.2545+10C＞T为有可能致病（disease-causing），结合先证者典型的结节性硬化症临床表现，判定为致病性变异。

图2 家系2 TSC2 基因chr:2124400 c.2545+10C＞T外显子测序图

图3 家系3 TSC1 基因chr9:135776981 c.2497C＞T外显子测序图

图4 家系4 TSC2 基因chr16:2134598c.4375C＞T外显子测序图

2 讨论

T S C是一种少见的遗传性神经皮肤综合征，以常染色体显性遗传方式遗传，发病率约为1/10000～1/6000[2-3]。TSC1或TSC2功能缺失性杂合变异为其致病原因。TSC1位于第9号染色体，包含23个外显子，TSC2位于16号染色体上，包含 42个外显子，两者分别编码错构瘤蛋白和马铃薯球蛋白[4]。两种编码产物在细胞内与TBC1结构域家族成员7（TBC1D7）形成一个蛋白质复合物，该复合物具有三磷酸鸟苷激活蛋白（guanosinetriphosphate activating protein，GAP）作用，作用于哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信号通路，通过PI 3 K/AKT信号转导通路和Ras/有丝分裂原激活蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信号转导通路，负向调节下游Rheb蛋白，并抑制其信号传递功能，进而抑制基因转录和蛋白合成，从而调控细胞周期、凋亡和自噬及细胞骨架重组[5]。TSC1或TSC2基因变异时，蛋白复合物的功能受到影响，失去对mTOR信号通路的抑制作用，对细胞生长、增殖、代谢抑制作用减弱，进而引起多器官功能损害[6]。

目前已发现TSC 1和TSC 2基因8种变异类型，1 000多个变异位点。在所有TSC变异中，TSC 2约占70%，TSC 1约占20%，约10%～20%未检测出突变。TSC1变异绝大多数为无义变异和移码变异，TSC2变异以错义变异最为常见，其次为大片段的缺失或重组[5,7]。本研究中2例TSC 1变异患儿均为无义变异，TSC2无义变异、剪切变异各1例，未见大片段缺失，1例未检测到致病变异，与既往报道的变异规律不完全相符，考虑与样本量较少有关。其中家系2和家系4为新发现的TSC 2变异，查阅文献其致病性均未见报道（参考数据库：HGMD Pro及PubMed），但二家系的先证者及其亲属的临床表型与基因变异相吻合，经预测蛋白质功能受到影响，因此判定为新发现的TSC致病性变异。

有文献报道，超过一半的TSC变异为自发变异，而TSC自发变异中至少15%为体细胞嵌合体，约1%为生殖细胞嵌合体[8]。体细胞嵌合体的亲代临床症状轻微，而子代却可能有严重的症状；生殖细胞嵌合体的亲代几乎没有症状，而在子代可以检测到与亲代相同的致病变异。本研究中先证者1的临床表现严重，其父母均未检测出相应变异，但母亲有轻微的皮肤表现，因此家系1可能为体细胞嵌合体，但先证者的2个姨母均有癫痫病史，未进行相关基因检测，尚不能明确是否家族性遗传。先证者5有典型的皮肤色素脱失斑、癫痫发作及智力低下表现，但未检测到变异。由于目前普通基因检测技术尚不能检测出嵌合体变异，推测其亦可能为嵌合体变异；此外可能存在未检测到的第3种变异基因、表观遗传修饰效应导致的转录沉默及未能检测出的内含子和调控区域发生的变异[9]。

TSC的临床表现复杂多样，且有年龄依赖性，在儿童常以癫痫发作和皮肤色素脱失斑起病。癫痫发作形式多样，其中婴儿痉挛症多见，常伴智力发育落后[10]。既往研究发现，TSC2变异的临床表现较TSC1变异严重，癫痫发生率更高，起病年龄更早，以婴儿痉挛症起病的概率更大，更容易遗留智力损害[11-12]。本研究中的先证者均以癫痫为首诊症状，起病年龄小，但TSC1变异者的平均发病年龄低于TSC2，且癫痫发作控制较TSC2欠佳，与既往报道不完全一致，推测癫痫预后与基因变异类型本身无关，而与起病的发作形式有关。由于TSC 2变异个体中婴儿痉挛症发生率更多，导致临床表现更加严重。TSC1、TSC2及无变异个体各有1例颅内多发钙化灶，且均以癫痫性痉挛发作起病，推测TSC 2变异个体更容易表现为癫痫性痉挛发作，可能与颅内钙化灶发生率高有关。研究发现，无变异和TSC2变异个体更容易发生肺和肾脏病变[13]，但临床表现较TSC2变异个体轻；与TSC1致病变异者相比，除更严重的肾和肺受累外，临床表现没有显著性差异[14]。本研究中5个家系的先证者均未见心脏、肾脏、肺部等其他病变，考虑与患儿年龄尚小有关，待进一步随访。

本研究中家系2、3的先证者致病变异分别来自其父亲、母亲，但其父母均无相似临床表现，家系4的先证者及其母亲、哥哥、姐姐具有相同的致病变异，但临床表现差异明显，3个家系均存在临床表现异质性、明显外显率不全的情况，这可能与一定的发病年龄依赖性、第二次打击的出现、体细胞突变以及尚未发现的基因修饰物有关[15]。

综上，本研究发现2个新的致病性TSC变异位点，1例为自发变异，丰富了国内的TSC突变谱，同一家系具有相同变异位点的个体临床表现可各不相同，为TSC研究提供了新的临床资料。基因检测作为一种重要的检测手段，对TSC尤其是无典型临床表现患儿的早期诊断、早期干预治疗进而提高患儿的预后及生存质量有重要价值。