储藏条件对开盖红方腐乳生物胺和理化性质的影响

马艳莉，梁静静，李大伟，丁玉峰，李素萍，席晓丽，王颉，郭书贤

(1.南阳理工学院 河南省工业微生物资源与发酵技术重点实验室，河南 南阳 473004；2.河北农业大学 食品科技学院，河北 保定 071000)

腐乳，类似于西方奶酪，是豆腐经霉菌或细菌固态发酵成毛坯，然后将毛坯用盐腌制，最后将盐坯在加有香辛料、酒类等混合辅料中成熟3个月左右[1,2]。腐乳是在开放式环境下制作而成，生产过程中所涉及的自然发酵过程易受环境中微生物的污染，且腐乳中含有丰富的氨基酸，含氮类化合物的不完全代谢会产生一些有害物质，如生物胺、氨基甲酸乙酯等[3]。

生物胺是一种有机含氮低分子化合物，主要由氨基酸的脱羧或醛酮的胺化和转氨作用形成，主要包括色胺、组胺、酪胺、腐胺、尸胺、精胺和亚精胺[4]。摄入一定的生物胺，对人体健康有危害，食品和药物管理局规定组胺在金枪鱼等相关鱼类中的限量值为50 mg/kg, 且总生物胺含量在500～1000 mg/kg会对人体健康产生潜在危害[5]。关于腐乳中生物胺的研究，大多数研究者集中在腐乳中生物胺分布的调查、接种不同毛霉对生物胺产生的影响、后发酵辅料对生物胺产生的影响等。例如，Kung等[6]对市售的32个腐乳样品中的生物胺进行了检测，共检测到8种生物胺，其中白方和红方腐乳中组胺平均含量低于50 mg/kg，只有1个红方腐乳样品中组胺含量高达158 mg/kg，具有安全隐患。对于储藏条件对腐乳生物胺的研究鲜有报道。

腐乳作为美味可口的佐餐小菜和烹饪中的调味料，通常人们开瓶后不会一次性食用完，而是放置于冰箱或室温保存。本研究旨在探讨不同储藏温度和储藏时间对开盖红方腐乳的生物胺含量和理化性质变化的影响，旨在为消费者提供合理的储藏方式和食用建议。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

红方腐乳：购自河北省保定市当地超市；色谱乙腈：购自上海Merck试剂有限公司；丹磺酰氯(HPLC，≥98%)：购自上海麦克林试剂有限公司；浓盐酸(37%)、氨水、乙酸铵、丙酮、无水乙酸钠、三乙胺、氢氧化钠、碳酸氢钠：购自天津市天力化学试剂有限公司；纯净水：购自杭州娃哈哈集团有限公司。

1.2 仪器与设备

高效液相色谱仪 美国Waters仪器有限公司；液相色谱柱Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm) 美国Agilent仪器有限公司；XHF-DY搅拌分离器 上海奥克斯仪器有限公司；5424R高速冷冻离心机 上海力申科学仪器有限公司；SPX生化培养箱 宁波东南仪器有限公司；QL-861涡旋机 海门市其林贝尔仪器制造有限公司；Novasina CH-8533水分活度仪 瑞士AG公司。

1.3 不同温度下开盖红方腐乳储藏试验

8瓶红方腐乳购自河北省保定市当地超市，开盖后在不同温度(4，15，25，35 ℃)下各放置两瓶，分别于储藏1，15，30，45，60 d取样测定。

1.4 生物胺含量测定

样品的前处理及生物胺的衍生参考李大伟等的方法[7]。

1.5 理化指标测定方法

水分活度的测定：使用水分活度测定仪测定，操作如下：在温度18～25 ℃、湿度50%～80%的条件下，首先用饱和的盐溶液校正仪器，准确称取约1 g(精确至0.01 g)样品，放入样品皿中，再封闭测量仓，然后测定读数。5 min后记录仪器的响应值。同一样品重复测定3次。

pH的测定：参照刘振锋的方法[8]。取5.0 g样品于50 mL离心管中，加入20 mL去离子水后用搅拌分离器均质，然后在4 ℃下3600×g离心25 min，取上清液转移至50 mL容量瓶中，并定容至刻度，用pH计测定，同一样品重复测定3次。

氨基酸态氮的测定：参照SB/T 10170-2007的方法[9]。

1.6 数据处理方法

采用SPSS 23.0 软件对数据进行方差分析，显著水平为p<0.05。

2 结果与分析

2.1 红方腐乳开盖贮藏过程中生物胺含量的变化

在不同温度下，随着储藏时间的延长，开盖红方腐乳中8种生物胺的含量变化见表1。

表1 红方腐乳开盖贮藏过程中生物胺含量的变化Table 1 Changes of biogenic amines content in lid-opened red sufu during storage mg/kg

续 表

在4 ℃储藏下，总生物胺呈先升高再降低的趋势，发现最高的生物胺含量(876.20 mg/kg)在储藏第15天的样品中检测到，是未经储藏样品总胺含量的10倍左右。对于每种胺，均在样品储藏第15天检测到最高值，为色胺(132.94 mg/kg)、苯乙胺(79.47 mg/kg)、腐胺(76.50 mg/kg)、尸胺(51.65 mg/kg)、组胺(280.21 mg/kg)、酪胺(45.24 mg/kg)、亚精胺(180.94 mg/kg)、精胺(29.26 mg/kg)，由此可知，储藏第15天的样品中主要的生物胺是色胺、组胺、亚精胺，分别占总生物胺的15.17%、31.98%和20.65%。随着储藏时间的延长，色胺、苯乙胺、酪胺、精胺均呈现先增加到最高值后呈现逐渐减小的趋势，特别是精胺在储藏第45天时几乎检测不到；腐胺、组胺、尸胺、亚精胺除了在第15天达到最高值，在第45天也会以高含量出现，所以在第45天高含量的生物胺是腐胺、组胺、尸胺、亚精胺的增加所导致的。

在15 ℃储藏下，储藏第15天的总生物胺含量与第60天的生物胺含量无显著差异，不同时间节点总生物胺含量高低排序为：第60天>第15天>第45天>第30天>第0天。每种胺的变化趋势也不一致，大多呈现波动趋势，且在储藏第15天检测到腐胺和组胺的最高值，在储藏第30天检测到色胺、苯乙胺和精胺的最高值，在储藏第60天检测到尸胺和亚精胺的最高值。值得注意的是，亚精胺在储藏第60天才检测到，且以高浓度出现，储藏最后出现的最高的生物胺总量(555.49 mg/kg)是由亚精胺的增加(0～153.77 mg/kg)引起的。而储藏第15天时较高的生物胺总量是由于组胺的骤然增加引起的，从28.37 mg/kg增加至290.02 mg/kg。

在25 ℃储藏下，总生物胺在储藏第15天检测到最高含量(596.63 mg/kg)，其中组胺占总生物胺的57.55%，为主要的生物胺。亚精胺在整个储藏过程都没有检测到，精胺只在储藏第15天和第30天检测到。除了尸胺和酪胺，所有生物胺的最高值在储藏第15天检测到，且大多生物胺的变化呈现波动趋势。

在35 ℃储藏下，总生物胺含量也是呈现波动趋势，也在储藏第15天出现了最高值(643.16 mg/kg)，其中组胺占总生物胺的53.03%。大多数胺包括色胺、苯乙胺、腐胺和组胺在储藏第15天出现最高值，酪胺在第30天出现最高值，这几种胺的变化与在25 ℃储藏下的变化趋势相同。

综合比较不同温度下储藏生物胺的变化趋势，发现不论在哪个温度下储藏，较高的总生物胺量均在第15天可以检测到；亚精胺随着温度的升高，含量减少至几乎检测不到；作为最主要和毒性最大的胺——组胺，在高温下更容易生成组胺。Ordonez等[10]研究了储存条件对开瓶葡萄酒中生物胺的影响，发现在不同储存条件检测到某些生物胺的浓度略有变化。Ngapo等[11]对加拿大猪肉在不同温度贮藏过程中生物胺的含量和变化过程进行研究，宰后48 h腰部位的猪肉分别在-1.7 ℃冷藏(分别于13，28，43，58 d取样)和4 ℃贮藏5 d，腐胺、精胺和亚精胺含量随冷藏时间的延长而增加；尸胺被检测出不受冷藏条件的影响，仅在-1.7 ℃贮藏至43 d后在部分样品中检测到。在整个贮藏过程中生物胺的浓度不高，不会造成中毒风险。

2.2 红方腐乳开盖贮藏过程中理化性质的变化

生物胺的生成与水分活度有密切的关联，水分活度通过影响微生物的生长代谢和微生物分泌的氨基酸脱羧酶活性间接影响生物胺合成。在不同温度下，随着储藏时间的延长，开盖红方腐乳水分活度的变化见图1。

图1 红方腐乳开盖贮藏过程中水分活度(Aw)的变化Fig.1 The change of water activity of lid-opened red sufu during storage

由图1可知，在25 ℃和35 ℃贮藏的红方腐乳，Aw的变化都呈先下降后上升的趋势，而在4 ℃和15 ℃贮藏的腐乳Aw变化规律与25 ℃和35 ℃相反，呈先上升后下降的趋势。所有样品的水分活度均大于0.85，为各种微生物的生长和酶的分泌提供了很好的水环境。

pH值主要是通过影响微生物的生长代谢和微生物分泌的氨基酸脱羧酶活性来影响生物胺的生成，其生成也被认为是微生物抵抗酸性环境的作用。Bubelova等[12]研究了不同pH(4，5，6，7，8)对沙雷氏菌CCM 303生长、腐胺和尸胺含量的综合影响，结果表明在pH 5～7的培养条件下，腐胺和尸胺浓度最高。Greif等[13]研究了NaCl浓度和初始pH值对GTY发酵液中产气肠杆菌和阴沟肠杆菌生成生物胺的影响。在含3% NaCl的肉汤中，尸胺和组胺浓度最高。在NaCl浓度为0.5%、pH值为6时，腐胺含量最高。在不同温度下，随着储藏时间的延长，开盖红方腐乳pH值的变化见图2。

图2 红方腐乳开盖贮藏过程中pH值的变化Fig.2 The change of pH values of lid-opened red sufu during storage

由图2可知，在4 ℃储藏下的pH值偏高，在15 ℃和25 ℃储藏下的pH值偏低，且从第0～45 d，pH值呈波动变化，45 d以后，所有温度下的pH都大幅度下降，除了在15 ℃下储藏的样品。

氨基酸态氮是指以氨基酸状态存在的氮元素，发酵产品中通过测定氨基酸态氮含量来了解氮源的量及被微生物利用的情况[14]。不同温度下，随着储藏时间的延长，开盖红方腐乳氨基酸态氮含量的变化见图3。

图3 红方腐乳开盖贮藏过程中氨基酸态氮含量的变化Fig.3 The change of amino acid nitrogen content of lid-opened red sufu during storage

红方腐乳在整个贮藏过程中，除25 ℃贮藏的腐乳外，其他3种贮藏温度下的腐乳FAAN含量有相同的变化规律。在15 ℃贮藏的红方腐乳在整个贮藏过程中FAAN含量变化不大，4 ℃贮藏的红方腐乳在第60天时FAAN达到最大值(0.42 g/100 g)，通过分析可得，FAAN和生物胺之间存在着一定的关系，在贮藏过程中FAAN含量的变化一定程度上也反映出总胺含量的动态变化，之前也有研究者表明氨基酸态氮与生物胺存在正相关[15]。

2.3 主成分分析

为了更直观地反映不同温度下储藏的样品与各种生物胺之间的关联，使用主成分分析法对8种生物胺进行主成分加权，由图4可知，前2个主成分解释了累计方差贡献率的98.1%，可以说明样品的大部分信息。其中除了组胺以外的7种胺均在主成分1的正半轴，其中酪胺和尸胺分布在主成分2的负半轴，其余的胺分布在主成分2的正半轴。

图4 主成分分析载荷图Fig.4 Load diagram of principal component analysis

图5 主成分分析的因子得分图Fig.5 Factor scoring chart of principal component analysis

由图5可知，在4 ℃下，更有利于促进亚精胺的生成；25 ℃和35 ℃储藏下的样品分布在组胺的象限中，说明在此温度下，可以促进组胺的合成；25 ℃和35 ℃储藏下的样品聚集在一起，说明在储藏过程中，这两个温度下的样品中生物胺的变化类似；随着储藏温度的升高，样品从主成分1的正半轴转向负半轴，更易受组胺含量的影响。

3 结论

通过对红方腐乳开盖后在不同温度条件下贮藏对生物胺影响的研究，初步明确了贮藏温度对红方腐乳开盖后生物胺的影响。腐乳在刚开盖时苯乙胺含量低于30 mg/kg，组胺含量低于100 mg/kg，酪胺低于100 mg/kg。在4种温度贮藏至第15天，苯乙胺和组胺含量分别超过30 mg/kg和100 mg/kg。在25 ℃和35 ℃贮藏的腐乳，前期(0～15 d)苯乙胺和组胺含量均显著高于其他两种贮藏温度下的腐乳。在35 ℃条件下贮藏的腐乳酪胺含量显著高于其他3个贮藏温度的腐乳，且在整个贮藏过程中酪胺含量均在100 mg/kg以下。从试验结果来看，腐乳开盖后即使在4 ℃贮藏，在第15天也可能出现组胺和苯乙胺中毒情况，综上所述，为了保证食用安全性，红方腐乳开盖后尽量在15 d内食用完。