传统风干牦牛肉加工中肌原纤维蛋白氧化与体外消化性变化

2020-07-25马纪兵宋艳艳余群力

农业工程学报 2020年12期

马纪兵，宋艳艳，张丽，杨超，韩玲，余群力

（甘肃农业大学食品科学与工程学院，兰州 730070）

0 引言

传统的风干牦牛肉是将切成条的牦牛肉在低温条件下自然风干（约 40 d）得到的肉制品。由于受传统饮食习惯的影响和对传统文化的传承，目前这种古老的加工方式在中国牧区仍然流行。而牦牛是这些高海拔牧区的特有畜种，风干牦牛肉含水率约 15%[1]，水分活度低于5.0[2]，大多数腐败微生物在此条件下无法生长[3]，是牧区传统的牦牛肉保藏方法。风干牦牛肉蛋白质质量分数为55%[1]，属于高蛋白食品，能够满足生活在较高海拔牧区的人们对高蛋白饮食的需求，因此受到牧民们青睐，然而目前对于这种高蛋白肉制品蛋白质消化性还未见报道。因此，有必要探讨加工过程中蛋白质的消化率变化以及影响蛋白质水解性的因素，对改善加工工艺和产品质量具有积极促进作用。

肉制品中蛋白质氧化和结构的变化会影响蛋白质被蛋白酶水解的速率，尽管轻度的蛋白质氧化可能导致蛋白质部分解折叠，使蛋白水解酶更容易与底物蛋白结合[4]，但在较重氧化条件下，蛋白质与蛋白水解酶结合的位点可能被修饰或蛋白质发生聚集而降低蛋白质被蛋白酶水解的敏感性[5]。在肉制品加工过程中，肌肉暴露于空气中，氧气和光等促进了蛋白质氧化程度[6]。另外，肉制品中脂质氧化是促进蛋白质氧化的另一重要原因，脂质氧化的特征是自由基链反应，会产生各种氧化副产物，如醛、酮和烷烃[7]，α、β-不饱和醛是脂质氧化过程中产生的亲电试剂，如丙二醛、4-羟基-2-壬烯醛和丙烯醛可与蛋白质的亲核基团反应[8]，导致蛋白质的许多结构变化；如修饰的氨基酸侧链，蛋白质交联和聚集，这可能会影响蛋白质对胃肠道酶的敏感性[9]。因此，肉类产品中脂质氧化、蛋白质氧化和蛋白质消化之间存在非常密切的关系。风干牦牛肉的加工过程中，生鲜肉长时间暴露于空气中，其脂质和蛋白质很可能被氧化。但关于风干牦牛肉加工过程中蛋白质氧化修饰及其对蛋白质消化率影响的研究鲜有报道。

本文引入一种特定模拟胃和十二指肠中蛋白质消化的模型[10]，以研究风干牦牛加工过程中的营养变化，旨在揭示风干牦牛肉加工过程中脂质氧化、肌原纤维蛋白氧化和蛋白质消化率的变化，并进一步探究蛋白质氧化引起的蛋白质结构变化对蛋白质消化性的影响，以期为改进现有加工技术或进一步开发新加工方法提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

材料：试验原料肉和风干牦牛肉加工均在甘肃安多清真绿色食品有限公司进行，选取3～4岁公牦牛半膜肌约20 kg作为混合试验样品。

试剂：牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin, BSA）购自美国 Sigma公司；胃蛋白酶（牛源）：酶活力≥400 U/mg，胰蛋白酶（牛源）：酶活力≥1 645 U/mg，α-胰凝乳蛋白酶（牛源）：酶活力≥1 500 U/mg，购于美国Sigma Aldrich公司；三氯乙酸（Trichloroacetic Acid,TCA）、2-硫代巴比妥（2-Thiobarbituric Acid, TBA）、四乙氧基丙烷（Tetraethoxypropane, TEP）、2,4-二硝基苯肼（2,4-Dinitrophenylhydrazine, DNPH）、十二烷基磺酸钠（Sodium Dodecyl Sulfonate, SDS）、5,5′-二硫代双硝基苯甲酸（5,5′-Dithio Bis-(2-Nitrobenzoic Acid), DTNB）、乙二胺四乙酸（Ethylene Diamine Tetraaceticacid, EDTA）、乙二醇双（2-氨基乙基醚）四乙酸（Ethylene Glycol Bis(2-Aminoethyl) Tetraacetic Acid, EGTA）、尿素、异硫氰酸胍、硫酸亚铁、碘酸钠、无水乙醇、KH2PO4、KCl、K2HPO4、KOH、MgC12、甲醇、氯仿和冰醋酸等均为分析纯试剂，购自北京索莱宝科技有限公司。

设备：JRJ-22型实验室用绞肉机（亿翔食品机械有限公司），马尔文激光粒度仪3000（美国Malvern公司），756P紫外分光光度计（上海光谱仪器有限公司），970CRT荧光分光光度计（苏州桃梅森科学仪器有限公司），TGL-16M 高速台式冷冻离心机（长沙湘仪有限公司），XHF-D型高速分散器（宁波新芝生物科技股份有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 试验设计

去除牦牛肉表面的筋膜和可见脂肪，切成横截面积2 cm×2 cm左右的条状，长约30 cm，悬挂于风干车间的铁丝上并且相互之间保持1～2 cm的距离，加工车间可以自然通风并避免阳光直射，在甘肃省夏河县1－3月较低的环境温度下进行自然风干（温度−15～−10℃，相对湿度50%～75%）。将一部分肉条切成小块，并迅速置于液氮中冷冻作为初始样品，其余在自然风干 2、4、6、8、10、15、20、25、30和40 d时采集样品并置于液氮中，后转移到−80℃超低温冰箱保存，每个指标测定重复3次。

1.2.2 指标测定

POV（Primary Oxidation Value）测定：按照《食品安全国家标准食品中过氧化值的测定》GB 5009.227-2016方法[11]。

TBARS（Thiobarbituric Acid Reaction Substrates）测定：参考Rasinska等[12]提出的方法并略作修改。准确称取10.0g样品，加入20 mL 20%（质量分数）TCA均质。混合液离心6 min（3 500×g，4 ℃），用定性滤纸过滤。取5 mL滤液与5 mL 20 mmol/L TBA溶液混合，置于沸水浴中加热20 min，以5 mL TCA和5 mL TBA混合液作为对照。冷却至室温并在532 nm处测定吸光度。TEP用于标准曲线绘制，以吸光度值为横坐标x1，TEP溶液浓度为纵坐标y1，标准曲线为y1=0.743x1+0.043（R2=0.999 4）。样品中TBARS的质量分数表示为mg/kg（以丙二醛计）。

肌原纤维蛋白提取：根据 Wu等[13]的方法并略作修改。称取肉样3.0 g，加8倍体积盐溶液（20 mmol/L磷酸钾缓冲液，0.1 mol/L KCl，2 mmol/L EGTA，2 mmol/L MgCl2，pH值6.8）均质，4 ℃条件下离心10 min（1 000×g），弃去上清，重复以上步骤 3次。沉淀用 8倍体积100 mmol/L KCl溶液溶解后，4 ℃离心 10 min（1 000×g）弃上清，重复 2次。采用双缩脲法定量蛋白，以吸光值为横坐标x2，以牛血清蛋白质量浓度（mg/mL）为纵坐标y2做标准曲线，曲线方程为y2=0.061 3x2+0.000 6（R2=0.999 7）。

羰基测定：依据 Berardo等[6]的方法略作修改。用100 mmol/L KCl溶液将肌原纤维蛋白浓度调整为5 mg/mL，取2份0.5 mL蛋白液，一份加2 mL含0.2%DNPH的2 mol/L HCl溶液，另一份加2 mL 2 mol/L HCl溶液作为对照，室温下避光反应1 h（每10 min旋涡振荡一次）。分别添加 2mL 20%三氯乙酸沉淀蛋白，离心（8 000×g，5 min）。沉淀用2 mL乙酸乙酯:乙醇（体积比1:1）清洗，重复3次。分别加3 mL 20 mmol/L磷酸盐缓冲液（含6 mol/L盐酸胍，pH值6.5）后置于37℃水浴中保温30 min溶解沉淀，离心（8 000×g，5 min），在370 nm处测定上清液吸光度。采用下式计算羰基含量

式中A1为 370 nm处吸光值；C为蛋白质质量浓度，mg/mL；ε1为摩尔消光系数 22 000 mol/(L·cm)。

总巯基测定：按照 Cui等[14]的方法稍作修改，用25 mmol/L磷酸钾缓冲液（pH值6.25）调整蛋白浓度为2 mg/mL。取0.5 mL依次加入2 mL尿素-SDS溶液（含8.0 mol/L尿素，30 g/L SDS，0.1 mol/L磷酸钾缓冲液，pH值7.4）和0.5 mL 10 mmol/L DTNB试剂（含0.1 mol/L磷酸钾缓冲液，pH值7.4），室温下反应静置15 min，取上清液在412 nm下测定吸光度，25 mmol/L磷酸缓冲液代替蛋白液用于空白对照。采用下式计算总巯基含量

式中A2为 412 nm 处吸光值；ε2为摩尔消光系数13 600 mol/(L·cm)。

二硫键测定：按照 Ma等[15]的方法进行测定。用25 mmol/L磷酸钾缓冲液（pH值6.25）调整蛋白质量浓度为5 mg/mL。取100μL蛋白液与3 mL新配制的NTSB溶液混合，在室温避光反应25 min，然后在412 nm下测定吸光度，25 mmol/L磷酸钾缓冲液代替蛋白液用于空白对照。采用下式计算二硫键含量

二聚酪氨酸测定：参考崔文斌[16]的方法并略加修改。将蛋白质溶于高离子强度缓冲液（0.6 mol/L，pH值6.0，20 mol/L磷酸盐）中。滤纸过滤除去残留脂肪和不溶性物质，滤液用双缩脲法测蛋白浓度，荧光光度法测定滤液中二酪氨酸含量。测定条件为：发射波长420 nm（狭缝5 nm），激发波长325 nm（狭缝5 nm）。测定结果用荧光强度除以蛋白浓度，表示为相对荧光值。

蛋白质粒径测定：采用Sun等[17]的方法，用马尔文激光粒度仪3 000测定蛋白质粒度的分布，粒径类型设定为非球形，密度为0.95 g/cm，分散剂为水。相对折射率和吸收率分别设定为1.54和0.001。获得的参数如下：D4,3表示按体积计算的平均粒径，Dx(10)、Dx(50)和Dx(90)分别表示占样品10%、50%和90%的蛋白质所达到的最大粒径。

蛋白质体外消化性测定：参考Wen等[18]的方法，略作修改。用33 mmol/L pH值1.8的甘氨酸缓冲液将蛋白液稀释至4 mg/mL，取3 mL与6 mL胃蛋白酶（5 U/mg）混合，总共6份，在37℃下进行酶解90 min后用1 mL 15%的三氯乙酸终止反应，离心（6 000×g，7 min），用双缩脲法定量其中3份剩余的不溶蛋白质量（m1，mg）。其余3份用33 mmol/L pH值8.0的甘氨酸缓冲液冲洗两遍，然后用3 mL 33 mmol/L pH值8.0的甘氨酸溶解，加入1 mL胰蛋白酶（6.6 U/mg）和α-胰凝乳蛋白酶（0.33 U/mg）的混合液，在37℃下酶解60 min，立即加入1 mL 15%的三氯乙酸终止反应，然后离心（8 000×g，7 min），用双缩脲法定量剩余的不溶蛋白质量（m2，mg）。用下式计算胃蛋白酶和胰蛋白酶对蛋白质的水解率。

1.3 数据分析

采用Excel 2010软件对数据进行处理（计算平均值和标准偏差）及绘图；采用SPSS Statistics 19.0软件对数据进行显著性和Pearson相关性分析，采用单因素方差分析 Duncan法比较风干牦牛肉加工不同时间点之间的差异，所有统计分析的显著水平均为P＜0.05。

2 结果与分析

2.1 脂质氧化变化

风干牦牛肉加工过程中POV和TBARS值变化如图1所示。

图1 风干牦牛肉加工过程中脂质氧化变化Fig.1 Change of lipid oxidation in air-dried yak meat during processing

POV值反映了脂质氧化初期主要氧化产物氢过氧化物的含量，氢过氧化物是诱导蛋白质发生氧化的促进因子之一[7]。随风干加工时间的延长，POV值呈现先增加后趋于稳定的趋势（图 1a），在第 15天时达最大值1.76 mmol/kg，15 d以后变化不显著（P＞0.05）。氢过氧化物不稳定，容易形成丙二醛等次级氧化产物，其含量用TBARS值表示。Mariutti等[19]认为氢过氧化物分解的主要途径是2个氧原子之间的裂解，这2个氧原子分别产生一个烷氧基和一个羟基自由基，然后该烷氧基可以进一步通过β-裂解产生脂质二级氧化产物。TBARS值的变化如图 1b所示，在整个风干加工过程中其值呈逐渐增加的趋势，尤其在10 d以后显著增加（P＜0.05），最大值达到 0.69 mg/kg。Ripoll等[20]指出肉类变质的TBARS阈值水平为2～2.5 mg/kg，本试验TBARS值未达到该范围。

2.2 蛋白质氧化变化

羰基是蛋白发生氧化的标志性产物，羰基含量增加代表蛋白氧化程度的增加[6]。图2中显示了风干牦牛肉加工过程中羰基含量变化。

图2 风干牦牛肉加工过程中羰基含量变化Fig.2 Change of carbonyl content in air-dried yak meat during processing

羰基化合物含量随风干时间的延长呈逐渐上升趋势。初始时为3.15 nmol/mg，至40 d时达到8.11 nmol/mg，增加了4.96 nmol/mg。肌肉蛋白质的氧化羰基化是一个不可逆的非酶促化学修饰[13]，蛋白质侧链羰基基团的形成主要来自赖氨酸、脯氨酸、精氨酸等的直接氧化，这类敏感性氨基酸先在自由基的攻击下形成氨基自由基，氨基离子再通过水合反应形成氨基酸侧链羰基衍生物[21]。因此，脂质氧化形成的氢过氧化物和丙二醛等自由基促进了风干牦牛肉蛋白质羰基化。

2.3 蛋白质交联变化

图 3反映了风干牦牛肉加工过程中总巯基、二硫键以及二聚酪氨酸含量的变化。

在整个风干加工过程中，总巯基含量显著下降（P＜0.05），和原料肉相比，至40 d时降低了31.03 nmol/mg（图 3a）。Lund等[22]也报道了类似的研究，他发现猪肉在冷藏期间总巯基数量显著减少。风干牦牛肉中二硫键含量（图 3b）则呈显著增加趋势（P＜0.05），肌肉蛋白质中半胱氨酸的巯基（-SH）容易被氧化形成二硫键（-S=S-），导致巯基含量下降和新的交联蛋白分子产生[23]。酪氨酸易受活性氧自由基攻击形成二聚酪氨酸，其含量可用相对荧光值来表示[16]，二聚酪氨酸含量变化如图 3c所示，在风干牦牛肉加工过程中呈逐渐增加趋势，在0～30 d内变化显著（P＜0.05）。以上结果表明，风干牦牛肉加工过程中蛋白质氧化后形成了二硫键和二酪氨酸，使蛋白质分子发生交联[10]。

图3 风干牦牛肉加工过程中蛋白质交联变化Fig.3 Change of protein cross-linking in air-dried yak meat during processing

2.4 蛋白质粒径大小分布变化

风干牦牛肉加工不同时间点肌原纤维蛋白粒径分布变化如表1所示。

表1 风干牦牛肉加工过程中肌原纤维蛋白粒径分布变化Table 1 Change of the myofibrillar protein particle size distribution in air-dried yak meat during processing

在风干加工最初的4 d内，Dx(10)、Dx(50)、Dx(90)和D4,3均显著降低（P＜0.05），在第4天时的值分别为4.72、53.21、194.86和89.45μm；在4～40 d内则显著增加（P＜0.05），至40 d时分别为24.43、147.08、234.52和139.78μm。Dx(10)、Dx(50)、Dx(90)和D4,3在第一阶段的降低可能是由于牦牛肉中内源酶对蛋白质的水解作用，使高分子量蛋白质降解为小分子蛋白质或肽以及游离氨基酸[17]。在第 4天后，Dx(10)、Dx(50)、Dx(90)和D4,3均逐渐增加，表明牦牛肉风干加工过程中产生了大分子蛋白质。这一现象可能是肌原纤维蛋白分子间形成的二硫键或二聚酪氨酸交联物导致小分子蛋白质结合生成了大分子蛋白质[24]。

2.5 蛋白质体外消化性变化

风干牦牛肉在加工过程中其肌原纤维蛋白体外消化率变化如图 4所示，用胃蛋白酶对蛋白质的水解来模拟胃消化，胰蛋白酶和α-胰凝乳蛋白酶共同对蛋白质的水解来模拟肠消化过程。

随着风干时间的延长，胃蛋白酶对肌原纤维蛋白的水解率逐渐降低（P＜0.05），由初始的62.36%降低至40 d时的33.92%，40 d时显著低于15 d（P＜0.05），极显著低于0～8 d（P＜0.01）。胰蛋白酶对蛋白质的水解率则呈现逐渐增加趋势（P＜0.05），在加工初始时，胰蛋白酶消化率为4.78%，至40 d时升高至13.64%。Santé-Lhoutellier等[5]发现如果胃蛋白酶在早期对蛋白质的水解作用较弱时，则留给了胰腺蛋白酶足够的反应底物，在后期胰蛋白酶和α-胰凝乳蛋白酶的降解作用会增强。然而胰蛋白酶和胃蛋白酶总水解率在整个加工过程中显著降低（P＜0.05），至40 d时降低至47.56%，降低了19.58%，40 d时显著小于30 d（P＜0.05），极显著小于0～15 d（P＜0.01）。可见蛋白质的消化性主要取决于胃蛋白酶的水解作用。

2.6 各指标间的相关性分析

风干牦牛肉在加工过程中，脂质氧化、蛋白氧化、蛋白粒径以及蛋白消化率各指标间的 Pearson相关系数（r）和显著水平如表2所示。

由表2可知，风干牦牛肉加工过程中，POV和TBARS与羰基、二硫键以及二聚酪氨酸呈极显著的正相关关系（P＜0.01），与巯基则呈极显著的负相关关系（P＜0.01）。Wang等[8]报道鲤鱼肌纤维蛋白中的羰基化合物随着丙二醛浓度的增加而增加[9]。Estévez[23]强调蛋白质与非蛋白质羰基化合物的共价结合是导致蛋白质羰基化的途径之一。Stadtman等[25]指出，肉中某些敏感氨基酸（如赖氨酸，脯氨酸，精氨酸等）侧链残基被一类活性基团攻击而直接氧化是产生羰基的主要原因之一，例如氢过氧化物。此外，丙二醛可与组氨酸残基 N末端形成席夫碱，并与谷氨酰胺的亲电性ε-氨基反应形成二氢吡啶[26]，这些生化反应可使蛋白质产生羰基化合物。

表2 各指标间的Pearson相关系数（r）Table 2 Pearson correlation coefficients (r) of various indexes

风干牦牛肉在加工过程中，二硫键和二聚酪氨酸的形成使蛋白质分子发生了交联[10]。丙二醛本身是亲核交联剂[27]，它可以与蛋白质中的 2个赖氨酸残基反应形成双席夫碱二亚胺交联物，这可能导致蛋白质分子内或分子间的交联[28]。一般认为自由基诱导的蛋白质氧化可发生二硫键和二聚酪氨酸的交联。自由基可以从半胱氨酸的巯基中夺取氢原子，然后 2个巯基结合形成二硫键并交联[10]。酪氨酸氧化后形成的二聚酪氨酸是肉类加工中另一种常见的交联形式[22]。Zhang等[29]认为在自由基存在条件下，二聚酪氨酸的生成可以通过两步催化氧化来实现，首先，酪氨酸的单电子氧化产生酪氨酸自由基，其次，2个单体酪氨酸自由基的组合形成二聚酪氨酸。总之，风干牦牛肉加工过程中脂质氧化促进了蛋白质氧化，导致蛋白质分子发生交联。

总蛋白水解率与羰基、二硫键以及二聚酪氨酸呈现出极显著的负相关关系（P＜0.01），与总巯基变化则表现出极显著的正相关关系（P＜0.01）。D4,3与二硫键以及二聚酪氨酸表现出极显著的正相关关系（P＜0.01）。可见牦牛肉在自然风干过程中，其肌原纤维蛋白消化性随蛋白氧化程度的增加而降低。根据Rysman等[30]的研究，蛋白质的氧化修饰使蛋白水解变得困难，因为α-酮酰基衍生物与N末端氨基酸的反应会阻止蛋白质水解酶对蛋白质的降解。Stadtman[25]认为肉类产品蛋白质中芳香族氨基酸（酪氨酸等）是被蛋白酶水解的切割位点之一，此类氨基酸发生氧化修饰会阻止蛋白质的降解。此外，Santé-Lhoutellier等[10]报道蛋白质氧化后发生分子内或分子间的交联，如二硫键、二聚酪氨酸等的生成引起蛋白质聚集，最终导致蛋白质的消化率下降。因此，从蛋白质氧化角度考虑，风干牦牛肉加工过程中其蛋白质消化率下降的原因有2个方面，一是部分氨基酸侧链被修饰，二是蛋白质交联物的生成使蛋白质分子粒径变大或聚集。以上变化均可引起蛋白水解酶与蛋白质的结合能力减弱，导致蛋白质水解率降低。总之，风干牦牛肉传统的加工工艺耗时过长，导致其脂质、蛋白质氧化程度增加和蛋白质消化性降低。今后可以引进热风干等加工技术以缩短加工时间；另外，在风干牦牛肉加工前先将牦牛肉采用抗坏血酸棕榈酸酯、维生素E、茶多酚等可食性抗氧化剂以及一些具有抗氧化作用的果蔬汁进行腌制处理，以期有效降低脂质氧化和蛋白质氧化程度和极大限度保证产品营养品质。