菌酶协同处理提高脱脂薏米水提取液营养价值

徐 磊，王清爽，高 珊，戴玉淇，王晓乐，陈晓明

（淮阴工学院生命科学与食品工程学院，淮安 223003）

0 引 言

薏米（Coix lachryma-jobiL.），禾本科，是一种广泛应用的药食两用资源，因其具有较高的商业价值已成为中国南方的典型经济作物。薏米富含蛋白、多糖、酚类、薏苡仁酯和薏米油等多种有益健康的生物活性成分[1-2]。国内外研究证实薏米具有抗肿瘤[3]、抗炎[4]、抗过敏[5]等多种药理活性。目前已基于薏米开发出多种高附加值的产品，其中薏米水提取液因具有改善皮肤粗糙、吸收紫外线、抗氧化和改善肠道菌群等多种功能，被广泛应用于化妆品和中药制剂中[6-7]。

微生物发酵法作为一种传统的食品加工手段，已被广泛用于各种谷物及副产物的深加工，可显著改善谷物及副产物的营养品质[8-9]。但单一的微生物发酵，存在产酶量低等问题，无法满足实际生产需求。采用菌酶协同发酵的方式，即在微生物发酵的同时加入一定量的蛋白酶、纤维素酶等酶制剂，可克服单独利用微生物发酵过程中产酶量不足的问题[10]。Sara等[11]通过在植物乳杆菌发酵扁豆的过程中添加枯草杆菌蛋白酶，显著提高了提取物中多肽、对羟基苯甲酸和黄酮含量（P＜0.05），提取物显示出较高的抗氧化、抗高血压和降血糖活性。张煜等[12]研究发现，菌酶协同发酵玉米-豆粕型饲料可显著提高饲料中β-伴球蛋白、大豆球蛋白、中性洗涤纤维降解率。邹俊哲等[13]研究发现，菌酶协同发酵可显著降解大米蛋白，提升蛋白水解液的血管紧张素转换酶抑制率。酶的选择对于菌酶协同发酵效果至关重要，但上述研究多是采用指定的酶制剂进行试验，而针对不同酶制剂对菌酶协同发酵的影响差异研究较少。

脱脂薏米作为薏米提油后的副产物，其水提取液已被用于化妆品、药品等行业，但存在功能性成分提取率低等缺陷，在一定程度上限制了其应用。采用菌酶协同方法处理脱脂薏米，研究其对脱脂薏米水提取液的影响，并考察不同蛋白酶的协同效果，国内外尚未见报道。本试验在干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）发酵脱脂薏米的过程中分别添加酸性蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、风味蛋白酶等 5种常见商业蛋白酶，考察菌酶协同处理对脱脂薏米发酵过程中蛋白质的降解效果，对薏米水提取液可滴定酸、还原糖、总酚、多肽、氨基酸、抗氧化活性及酪氨酸酶和黄嘌呤氧化酶抑制活性的影响，以期阐明菌酶协同处理对脱脂薏米水提取液营养品质的影响，为薏米资源的综合利用提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料

脱脂薏米粉：本实验室自制。新鲜薏米购自贵州鑫龙食品开发有限公司，去杂粉碎，过60目筛，正己烷浸泡脱脂2次（1:8，质量体积比），40 ºC烘干。所得脱脂薏米粉蛋白质量分数为19%，淀粉质量分数为63%。

干酪乳杆菌（1011CFU/g），山东中科嘉亿生物工程有限公司；酸性蛋白酶（最佳反应温度为 50 ℃，pH值为4，酶活10.0×104U/g）、木瓜蛋白酶（最佳反应温度为50 ℃，pH值为7，酶活10.0×104U/g），宁夏夏盛实业集团有限公司；中性蛋白酶（最佳反应温度为50 ℃，pH值为7，酶活9.5×104U/g）、碱性蛋白酶（最佳反应温度为50 ℃，pH值为8，酶活9.7×104U/g）、风味蛋白酶（最佳反应温度为50 ℃，pH值为7，酶活9.8×104U/g），诺维信（中国）生物技术有限公司；2,2′-联氮双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二铵盐（2,2′-Azino-Bis(3-Ethylbenzothiazoline-6-Sulfonic Acid) Diammonium Salt，ABTS）、奎诺二甲基丙烯酸酯（(±)-6-Hydroxy-2,5,7,8-Tetramethylchromane-2-Carboxylic Acid，Trolox）、酪氨酸酶、黄嘌呤氧化酶等，美国 Sigma公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 试验仪器

BSC-150恒温恒湿箱，上海博迅实业有限公司；FD5-5/T冷冻干燥机，美国Labconco公司；LC-2030液相色谱仪，日本岛津公司；Cary 60紫外可见分光光度计、Agilent1100及Agilent1260氨基酸分析系统，美国安捷伦公司。

1.3 处理方法

准确称取30 g脱脂薏米粉，按料液比1:1（g/mL）混合均匀。按2 g/100 g薏米粉接种干酪乳杆菌，按1%加酶量添加蛋白酶（酸性蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、风味蛋白酶），搅拌3 min，37 ℃密封发酵48 h。发酵结束后将样品立即冷冻干燥（干燥室真空度1 Pa，48 h），粉碎过100目筛，−20 ℃储存备用。单独发酵时只接种干酪乳杆菌而不添加任何蛋白酶。单独蛋白酶酶解时，时间较短时效果较差，但长时间酶解易产生异味，因此本论文未做单独蛋白酶酶解对照。

取3 g发酵薏米粉，加入30 mL去离子水，25 ℃振荡提取2 h，4 ℃ 3 500×g离心10 min，收集上清液，此即为发酵薏米水提取液。

1.4 测定指标及方法

可滴定酸含量的测定：参考Oyewole等[14]的方法测定发酵薏米水提取液中可滴定酸含量，结果以每毫升含毫克乳酸表示（mg/mL）。

还原糖含量的测定：参考张小贝等[15]的方法测定发酵薏米水提取液中还原糖含量，结果以每毫升含毫克葡萄糖表示（mg/mL）。

总酚含量的测定：利用福林酚法测定总酚含量[16]。取0.2 mL提取液于离心管中，依次加入1.3 mL去离子水和0.25 mL福林酚试剂，振荡混匀后静置6 min，然后再分别加入0.75 mL 20% Na2CO3和2.5 mL去离子水，充分混匀后在40 ℃下黑暗处反应2 h，于760 nm处测定吸光值x1。采用没食子酸绘制标准曲线（y1=0.009 7x1+0.008 6，R2=0.999 7），结果以μg/mL表示。

蛋白分子量分布测定：取0.1 g发酵薏米样品和4 mL磷酸钠缓冲溶液（0.05 mol/L，pH值6.8，含2% SDS）于 10 mL离心管中充分混匀，室温旋转提取 12 h，10 000×g离心15 min，取上清液过0.45μm微孔滤膜后进行高效液相分析。条件如下：Shodex Protein KW-804 凝胶柱；流动相为0.05 mol/L磷酸钠缓冲溶液（pH值6.8，含0.2% SDS）；柱箱温度为30 ℃；流速0.7 mL/min，检测波长214 nm。

多肽分子量分布测定：取0.1 mL提取液于离心管中，加入0.1 mL体积分数40%乙腈，充分混匀，经10 000×g离心15 min后，取上清液过0.45μm微孔滤膜后进行凝胶色谱分析。条件如下：TSK gel 2 000 SWXL凝胶柱（300 mm×7.8 mm）；流动相为乙腈/水/三氟乙酸（10/90/0.1，体积比）；流速0.5 mL/min；检测波长220 nm。

游离氨基酸组成分析：参照《食品中氨基酸的测定：GB 5009.124-2016》，分析发酵薏米水提液中的17种游离氨基酸。

铁离子还原能力（Ferric Reducing Antioxidant Power，FRAP）测定[17]：取90μL提取液于离心管中，然后分别向其中加入270μL去离子水和2.7 mL FRAP试剂，混合均匀后于黑暗处室温反应30 min，测定593 nm处吸光值x2。采用 Trolox绘制标准曲线（y2=1.914 6x2−0.131 0，R2=0.999 3），结果以μmol/mL表示。

清除 ABTS·+（ABTS Radical Cation）能力测定[18]：取 100μL提取液于离心管中，然后向其中加入 3.9 mL ABTS·+稀释液，混合均匀后于黑暗处室温反应15 min，测定 734 nm处吸光值x3。采用 Trolox绘制标准曲线（y3=−4.391x3+1.662 9，R2=0.998 7），结果以μmol/mL表示。

酪氨酸酶和黄嘌呤氧化酶抑制率测定：参照Xu等[19]的方法进行水提取液的酪氨酸酶和黄嘌呤氧化酶抑制率测定，无样品组和添加样品组的斜率分别记为S0和S1，并按如下公式计算抑制率。

1.5 数据处理

采用 SPSS 19.0软件检验分析比较试验各组间均值差异显著性（P＜0.05），试验结果以平均值±标准偏差表示，使用Origin 9.0软件绘图。

2 结果与分析

2.1 菌酶协同处理对薏米蛋白分子量分布的影响

分子排阻色谱技术可对分子量分布较宽的蛋白进行高效的分离和定量，已被广泛应用于多种植物蛋白生物处理过程中分子量变化的表征[20-21]。从图 1可以看出，薏米蛋白主要集中在20.0～97.4 kDa（F2区域），而分子量高于97.4 kDa（F1区域）和低于20.0 kDa（F3区域）的蛋白较少。单独发酵后，位于F2区域的峰2、3和4面积显著降低，而位于F3区域的峰5面积显著提高，说明薏米在发酵过程中高分子量的蛋白质发生显著降解，生成大量的多肽和氨基酸。与单独发酵相比，添加蛋白酶均可进一步促进发酵过程中薏米蛋白的降解，菌酶协同处理后位于F2区域的峰2和3面积显著降低，而位于F3区域的峰5、6和7面积显著提高。其中以添加木瓜蛋白酶和酸性蛋白酶的效果最佳，经木瓜蛋白酶协同发酵后峰1、2和3基本消失。与单独发酵相比，添加风味蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶和中性蛋白酶可显著提高位于F2区域的峰4，而添加酸性蛋白酶后峰4面积显著降低，这可能是由于菌酶协同处理可以使分子量较高的蛋白质（峰2、3）降解为分子量较低的蛋白质（峰4），同时可以进一步降解峰4蛋白质转化为F3区域的多肽和氨基酸。蛋白酶酶解具有专一性，另外固态发酵一般不对物料pH值进行控制，使部分蛋白酶无法在其最佳条件下使用，因而导致了不同蛋白酶在菌酶协同发酵过程中薏米蛋白降解效果的差异。孙宏[22]研究也发现添加蛋白酶可促进棉籽粕发酵过程中蛋白质的降解，与本文结果一致。

图1 菌酶协同处理脱脂薏米蛋白分子量分布的变化Fig.1 Changes of protein molecular weight distribution of defatted adlay by fermentation with enzyme addition

2.2 菌酶协同处理对水提取液可滴定酸、还原糖和总酚浓度的影响

菌酶协同处理对薏米水提取液可滴定酸、还原糖和总酚浓度的影响如表1所示。由表1可知，未发酵薏米水提取液的可滴定酸为0.24 mg/mL，单独发酵后增加到3.96 mg/mL，添加蛋白酶发酵后水提取液可滴定酸显著上升（P＜0.05），达到5.04～7.38 mg/mL。蛋白酶降解薏米蛋白产生的多肽和氨基酸可促进干酪乳杆菌的生长代谢，进而产生更多的乳酸，使体系滴定酸度提高[23-24]。未发酵薏米水提取的还原糖浓度为3.53 mg/mL，单独发酵后上升到6.17 mg/mL，提高了74.8%。与单独发酵相比，除了添加碱性蛋白酶组还原糖浓度（5.81 mg/mL）略有降低，其他蛋白酶添加组水提取液还原糖浓度（6.64～14.32 mg/mL）都显著增加（P＜0.05），其中中性蛋白酶添加组增加最大，提高了132.1%。

单独发酵后水提取液的总酚浓度由64.28μg/mL上升至100.15μg/mL，提高了55.8%。与单独发酵相比，添加蛋白酶后水提取液总酚浓度（152.35～327.32μg/mL）均显著增加（P＜0.05），其中酸性蛋白酶添加组增加最大，提高了226.8%。谷物中的多酚类物质以结合态和游离态形式存在，发酵过程中显著增强的蛋白酶、纤维素酶活力可促进结合态酚的释放，使水提取液中总酚浓度升高[25-26]。

表1 菌酶协同处理脱脂薏米水提取液可滴定酸、还原糖和总酚浓度的变化Table 1 Changes of titratable acid, reducing sugar and total phenolic contents of defatted adlay water extract by fermentation with enzyme addition

2.3 菌酶协同处理对水提取液多肽分子量分布的影响

菌酶协同处理后薏米水提取液的多肽分子量分布如表2所示。从表2中可以看出未发酵薏米水提取液中相对分子质量超过 5 000 Da的大分子多肽所占比例为15.37%，在单独发酵后比例显著降低（5.07%），添加蛋白酶发酵后比例进一步降低（0.83%～3.27%），其中添加酸性蛋白酶和木瓜蛋白酶的效果最为明显。相对分子质量在＞3 000～5 000 Da、＞2 000～3 000 Da、＞1 000～2 000 Da的多肽在单独发酵后比例均略有上升，而与单独发酵相比，添加蛋白酶后此部分多肽比例均显著降低（P＜0.05）。未发酵薏米水提取液中相对分子质量在＞180～500 Da的多肽（二肽、三肽和四肽）为20.45%，在单独发酵后比例显著增加（27.45%）（P＜0.05），菌酶协同处理后此部分多肽进一步增加，添加酸性蛋白酶组比例达到50.45%。未发酵薏米水提取液中相对分子质量低于180 Da的游离氨基酸比例达46.07%，单独发酵后比例略有降低（42.12%），菌酶协同处理后除了添加风味蛋白酶组（46.57%）其比例均进一步降低（35.10%～41.84%）。菌酶协同发酵过程中，由于来源于菌种和外加蛋白酶的共同作用，薏米蛋白质可被水解生成大量的多肽和氨基酸，导致发酵后水提取液多肽分子量分布的显著变化。

2.4 菌酶协同处理对水提取液游离氨基酸的影响

菌酶协同处理后薏米水提取液中17种游离氨基酸（8种必需氨基酸和9种非必需氨基酸）含量如表3所示。未发酵薏米水提液总游离氨基酸质量浓度为69.99μg/mL，经过干酪乳杆菌发酵后水提取液总游离氨基酸为409.01μg/mL，是未发酵的 5.84倍。与单独发酵相比，添加蛋白酶后水提取液总游离氨基酸含量都显著提高（P＜0.05），不同蛋白酶添加组的总游离氨基酸变化趋势与薏米蛋白分子量分布变化趋势是一致的，其中添加酸性蛋白酶和木瓜蛋白酶效果最好，总游离氨基酸质量浓度分别为3 075.50和3 292.60μg/mL，较单独发酵分别增加了6.52和7.05倍。发酵后水提取液中各游离氨基酸含量较未发酵前都显著提高（P＜0.05），同时菌酶协同组各游离氨基酸含量显著高于单独发酵组（P＜0.05）；必需氨基酸中亮氨酸含量增加最多，单独发酵和添加酸性蛋白酶发酵较未发酵前分别提高了 41.98和750.08μg/mL；非必需氨基酸中谷氨酸含量增加最多，单独发酵和添加木瓜蛋白酶发酵较未发酵前分别提高了56.92和330.10μg/mL。未发酵前水提液EAA/NEAA和EAA/TFAA值分别为0.54和0.35，单独发酵后分别增加到0.67和0.40，而添加蛋白酶发酵后值分别为0.73～1.17和0.42～0.54，菌酶协同处理显著提高了水提取液中必需氨基酸的比例（P＜0.05）。

表2 菌酶协同处理脱脂薏米水提取液多肽分子量分布的变化Table 2 Changes of peptide molecular weight distribution of defatted adlay water extract by fermentation with enzyme addition%

表3 菌酶协同处理脱脂薏米水提取液游离氨基酸的变化Table 3 Changes of free amino acids composition of defatted adlay water extract by fermentation with enzyme addition(μg·mL-1)

2.5 菌酶协同处理对水提取液抗氧化活性的影响

薏米水提取液的抗氧化活性变化如图 2所示，结果表明菌酶协同处理可显著提高水提取液的 FRAP和ABTS·+清除能力。未发酵薏米水提取液的 FRAP和ABTS·+清除能力分别为0.206和0.260μmol/mL，单独发酵后分别增加到0.330和0.406μmol/mL。与单独发酵相比，菌酶协同处理可进一步提高水提取液的 FRAP和ABTS·+清除能力（P＜0.05），其中添加木瓜蛋白酶的效果最好，分别达到了0.629和0.683μmol/mL，而风味蛋白酶的效果最差，分别为0.439和0.514μmol/mL。菌酶协同处理过程中水提取液显著增加的多酚、多肽和氨基酸含量都可能在一定程度上促进其抗氧化活性的提高。木瓜蛋白酶、酸性蛋白酶和中性蛋白酶对薏米蛋白酶解能力较强，协同发酵过程中可释放较多的抗氧化活性物质，因而其水提取液表现较高的抗氧化活性；风味蛋白酶和碱性蛋白酶对薏米蛋白酶解能力较差，协同发酵过程中释放抗氧化活性物质较少，水提取液抗氧化活性因而也较低。Sara等[27]研究也发现，相较于单独发酵菌酶协同处理可显著提高扁豆水溶性提取液的抗氧化活性。

图2 菌酶协同处理脱脂薏米水提取液抗氧化活性的变化Fig.2 Changes of antioxidant activity of defatted adlay water extract by fermentation with enzyme addition

2.6 菌酶协同处理对水提取液酪氨酸酶和黄嘌呤氧化酶抑制活性的影响

酪氨酸酶是黑色素形成过程中的关键限速酶，在皮肤变黑过程中扮演着重要作用，而黄嘌呤氧化酶是尿酸合成途径中的关键酶，其过量表达易引发痛风、高尿酸血症等疾病[28-29]。薏米水提取液的酪氨酸酶和黄嘌呤氧化酶抑制活性变化如图 3所示，结果表明菌酶协同处理可显著提高水提取液的酪氨酸酶和黄嘌呤氧化酶抑制活性。菌酶协同处理后，水提取液中显著增加的多肽、多酚等物质都可能提高其对酪氨酸酶和黄嘌呤氧化酶抑制作用[30-31]。单独发酵后，薏米水提取液的酪氨酸酶和黄嘌呤氧化酶抑制活性分别从 27.4%和 10.3% 增加到46.5%和22.1%。与单独发酵相比，菌酶协同处理后水提取液的酪氨酸酶和黄嘌呤氧化酶抑制活性进一步提高，分别达到了52.3%～58.1%和36.7%～41.5%。其中添加木瓜蛋白酶组的酪氨酸酶和黄嘌呤氧化酶抑制活性显著高于其他组（P＜0.05），这可能是由于木瓜蛋白酶对薏米蛋白具有较强的酶解能力，菌酶协同发酵过程中更能促进多肽和多酚等物质的释放。

图3 菌酶协同处理脱脂薏米水提取液酪氨酸酶和黄嘌呤氧化酶抑制活性的变化Fig.3 Changes of inhibitory effects of defatted adlay water extract on tyrosinase and xanthine oxidase by fermentation with enzyme addition

3 结 论

1）与单独发酵相比，菌酶协同可促进薏米发酵过程中蛋白质的进一步降解，生成大量的多肽和氨基酸。菌酶协同处理后，水提取液中多肽、还原糖和总酚浓度显著上升（P＜0.05），分子量大于5 000 Da的多肽比例减少到0.83%～3.27%，游离氨基酸含量显著提高（P＜0.05），必需氨基酸与非必需氨基酸比值（EAA/NEAA）达到0.73～1.17。

2）菌酶协同处理后水提取液的FRAP和ABTS·+清除能力显著增强（P＜0.05），酪氨酸酶和黄嘌呤氧化酶抑制活性分别达到了52.3%～58.1%和36.7%～41.5%，显著高于单独发酵组（P＜0.05）。

3）菌酶协同可以增强脱脂薏米水提取液的营养价值，使其成为更好的配料应用在食品和化妆品等领域，木瓜蛋白酶相较于其他蛋白酶具有更好的协同增效作用。