清旨宁胶囊中沙棘成分薄层色谱鉴别方法

2020-07-24邓辰辰许明君相继芬王婧丁艳柏伟荣

食品工业 2020年7期

邓辰辰，许明君，相继芬, ，王婧，丁艳，柏伟荣

1. 江苏康缘药业股份有限公司（连云港 222047）；2. 中药提取精制新技术重点研究室（连云港 222047）

清旨宁胶囊是一种主要以沙棘、肉苁蓉、丹参、红曲等为原料制成的保健食品，具有降血脂的功效。主要制剂工艺为：将沙棘、肉苁蓉、丹参按配方比例称其质量，加入适量水，煎煮合并滤液，浓缩，喷雾干燥，制粒，加入红曲总混，添加辅料后灌装成胶囊或压片包衣。为了保证制剂的品质，建立品质标准，现对其中的主要成分沙棘进行薄层色谱鉴别。

薄层层析技术是发展较早的色谱方法之一，其基本原理是利用混合物各组分在某一物质中的吸附或者分配等性能的不同，使样品溶液中各种物质进行反复的吸附或者分配等作用，从而将各种组分分开。研究[1-5]中，对沙棘成分的TLC鉴别均参考药典[6]方法，鉴别其中的黄酮类成分。药典方法前处理复杂，需自制含3%醋酸钠的硅胶G板且存在阴性干扰。研究建立的鉴别方法快速、简便、重复性好，为含有沙棘、肉苁蓉、丹参、红曲等成分的产品研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器与试药

1.1.1 仪器与设备

ZF-20D型暗箱三用紫外分析仪（上海越众仪器设备有限公司）；KQ-250DB型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；BSA 224S-CW型电子分析天平（德国赛多利斯公司）；BP 211D型电子分析天平（德国赛多利斯公司）；HPD 260型恒温恒湿箱（德国美墨尔特有限公司）；DHG-9145A型热风循环烘箱（上海一恒科学仪器有限公司）；HWS26型电热恒温水浴锅（上海一恒科学仪器有限公司）。

1.1.2 对照药材与对照品

沙棘对照药材（批号121519-200501，中国药品生物制品检定所）；异鼠李素对照品（纯度99.9%，批号110860-201410，中国食品药品检定研究院）；槲皮素对照品（纯度99.1%，批号100081-201610，中国食品药品检定研究院）；齐墩果酸对照品（纯度91.7%，批号110709-201607，中国食品药品检定研究院）。

1.2 试剂与材料

硅胶G薄层层析板（青岛海洋化工有限公司、青岛胜海精细硅胶化工有限公司、安徽良臣硅源材料有限公司、青岛裕民源硅胶试剂厂）；薄层层析硅胶G（青岛海洋化工有限公司）；其余试剂为分析纯（南京化学试剂股份有限公司）。

1.3 试验样品

清旨宁胶囊（批号20171201、20171202、20171203）共3批次，为江苏康缘现代中药研究院研制。

2 方法与结果

2.1 参照药典方法鉴别沙棘

2.1.1 对照品溶液制备

取异鼠李素和槲皮素对照品，加甲醇制成浓度1 mg/mL的混合对照品溶液。

2.1.2 对照药材溶液制备

精确称取0.5 g沙棘对照药材粉末，置于具塞锥形瓶中，加入50 mL 95%乙醇，称其质量，加热回流提取1 h后，冷却至室温，称其质量，用95%乙醇补足损失的质量，摇匀后过滤。吸取25 mL续滤液，置具塞锥形瓶中，加入3.5 mL盐酸，于75 ℃水浴中加热水解1 h，立刻冷却，转移至50 mL容量瓶中，用95%乙醇少量多次洗涤锥形瓶，洗液并入同一容量瓶中，定容，摇匀后过滤。吸取30 mL续滤液，浓缩至约5 mL，加25 mL水，于分液漏斗中用乙酸乙酯提取2次，每次20 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，加入1 mL甲醇溶解残渣，作为对照药材溶液[6]。

2.1.3 供试品溶液制备

取2 g胶囊内容物粉末，按照上述对照药材处理方法，制备供试品溶液。

2.1.4 阴性样品溶液制备

取除沙棘以外的其他处方药味，按处方比例及制剂工艺制备阴性制剂，按供试品溶液制备方法，制备阴性样品溶液。

2.1.5 薄层色谱鉴别

吸取对照品溶液、对照药材溶液、供试品溶液、阴性样品溶液各2 μL，分别点于同一含3%醋酸钠溶液制备的硅胶G薄层板（自制）上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸（5∶2∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以三氯化铝试液，置紫外光灯（365 nm）下检视[6]。结果见图1。

图1 药典方法沙棘TLC图

由图1可以看出，阴性有干扰，药典方法不适合该产品中沙棘的TLC鉴别。取四味原料药材分别按制剂工艺制备单味药材制剂，按上述方法进行鉴别，结果见图2。

从图2可以看出，各单味药材制剂与对照品溶液相同位置处均有荧光斑点。分析结果，应该是其他药材中的黄酮类成分大部分以异鼠李素、槲皮素、山柰酚为母核，含氧杂环化合物与三氯化铝试液反应显色，从而干扰沙棘的鉴别，导致假阳性。

图2 单味药材制剂TLC图

2.2 自建方法鉴别沙棘

2.2.1 对照品溶液制备

取齐墩果酸对照品，用甲醇溶解，制成1 mg/mL的溶液，作为对照品溶液。

2.2.2 对照药材溶液制备

称取0.5 g沙棘对照药材粉末约，加入20 mL三氯甲烷，超声处理30 min，过滤后蒸干，加1 mL甲醇溶解残渣，离心后取上清液作为对照药材溶液。

2.2.3 供试品溶液制备

取2 g胶囊内容物粉末，对照药材处理方法，制备供试品溶液。

2.2.4 阴性样品溶液制备

取除沙棘以外的其他处方药味，按处方比例和制剂工艺制备阴性制剂，按供试品溶液制备方法，制备阴性样品溶液。

2.2.5 薄层色谱鉴别

吸取对照品溶液、对照药材溶液、阴性样品溶液各4 μL，供试品溶液各1，2和4 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-甲酸（40∶1∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在110 ℃加热至斑点显色清晰。结果见图3。

供试品色谱中，在与对照品和对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。色谱斑点清晰可见，Rf值合适，分离度较好，无阴性干扰。样品和对照品的点样量在4 μL时分离效果好，斑点清晰。故采用该方法进行沙棘薄层鉴别方法学考察，专属性较好。

2.3 耐用性考察

2.3.1 展开剂考察

考察3种展开系统：A，三氯甲烷-甲醇-甲酸（40∶1∶1）；B，二氯甲烷-甲醇-甲酸（40∶1∶1）；C，三氯甲烷-乙醇-甲酸（40∶1∶1）；点样量4 μL。结果见图4。

可以看出，选择展开系统A时，斑点清晰可见，分离度较好，故确定三氯甲烷-甲醇-甲酸（40∶1∶1）为TLC鉴别条件。

图3 自建方法沙棘TLC图

图4 沙棘TLC展开系统考察

2.3.2 不同薄层板考察

选择不同厂家薄层板（青岛海洋化工有限公司、安徽良臣硅源材料有限公司、青岛裕民源硅胶试剂厂），点样量4 μL，按照2.1.5的方法展开，显色。结果见图5。3种硅胶G板都可以达到较好分离效果，且斑点清晰。说明方法对不同厂家薄层板耐用性较好。

图5 沙棘TLC薄层板考察

2.3.3 温度的考察

采用同一厂家的薄层板（青岛海洋化工厂分厂），考察不同温度（低温4 ℃和室温20 ℃）条件对薄层鉴别的影响，结果见图6。

可以看出，在不同温度4 ℃和20 ℃下，对照品溶液与供试品溶液薄层色谱图斑点无明显拖尾现象，分离度较好，但温度过低时供试品斑点较模糊。相比较而言，20 ℃时分离效果较好，说明薄层鉴别方法的温度耐用性良好。

图6 沙棘薄层鉴别温度考察

2.3.4 湿度的考察

采用同一厂家的薄层板（青岛海洋化工厂分厂），在一小房间中用除湿机和加湿器控制环境湿度，考察不同湿度（40%，60%和80%）条件对薄层鉴别的影响，结果见图7。

从图7可知，在3种不同相对湿度（40%，60%和80%）的条件下展开，对照品、对照药材溶液和供试品溶液的TLC斑点均能实现分离，分离度较好；但相对湿度过高时，斑点拖尾较明显，说明薄层鉴别方法的湿度耐用性良好。

图7 沙棘薄层鉴别湿度考察

2.4 3批次制剂中沙棘TLC鉴别

图8 3批次制剂中沙棘薄层鉴别验证

取3批次制剂成品，研细混匀，分别取2 g粉末，加20 mL三氯甲烷，超声处理30 min，过滤后蒸干，加1 mL甲醇溶解残渣，离心后取上清液作为供试品溶液。吸取对照品溶液、对照药材溶液、供试品溶液、阴性样品溶液各4 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-甲酸（40∶1∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在110℃加热至斑点显色清晰，结果见图8。结果显示，供试品溶液薄层色谱图中，在与对照品和对照药材溶液薄层色谱的相应位置上，显示相同颜色的斑点，Rf值合适，分离度较好。