QuECHERS-UHPLC-MS/MS法测定牛肉干中罗丹明B

毛敏霞，黄永桥，马凯，简银池，李占彬

贵州省分析测试研究院（贵阳 550000）

罗丹明B（Rhodamine B），又名玫瑰红B、碱性玫瑰精、蕊香红B，俗称花粉红，是一种人工合成三苯甲烷类碱性荧光染料，以氧杂蒽为母体，具有特殊的荧光特性，被广泛应用于造纸、纺织、皮革和环保等领域，是荧光分析常用的试剂[1-3]。因其具有高毒、高残留和致癌、致畸、致突变等特点[4-6]，被国家列入《食品中可能违法添加的非食用物质和易滥用的食品添加剂品种名单（第一批）》明令禁止在食品中添加[7]。根据整顿办函[2011]1号、食品整治办[2008]3号等文件精神，罗丹明B作为食品中可能违法添加的非食用物质和易滥用的食品添加剂，被纳入食品安全监督抽检检测项目。但罗丹明B具有着色持久、成本低廉且稳定性强等特点，常被一些不法商贩将其替代食品着色剂使用，给消费者饮食安全带来极大隐患[8-9]。因此建立可靠的分析方法是必要的，以加强市场监管，打击非法滥用。

目前已有报道关于罗丹明B检测方法有分光光度法[9-10]、高效液相色谱（HPLC）法[12-14]、高效液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS）法[15-16]、表面增强拉曼（SERS）法[17-18]。罗丹明B常用的检测标准为SN/T 2430—2010《进出口食品中罗丹明B的检测方法》，样品提取后经凝胶色谱净化系统（GPC）净化，最后经仪器测定[19]。但检测标准中用到的凝胶色谱净化系统在一些基层实验室难以普及，且这些检测方法前处理过程较为繁琐、耗时较长，很难满足快速筛查要求。QuEChERS技术最初用来分析水果和蔬菜中的多种农药残留，也用来分析如水产品和畜禽肉等非蔬菜类物质中痕量污染物，市售QuEChERS产品种类较多。试验采用QuEChERS法对样品进行处理，利用超高效液相色谱-串联质谱仪，建立测定牛肉干中罗丹明B的分析方法。该方法具有前处理简单、样品分析时间短、回收率高、准确度和精密度好等优点，适用于大批量样品的快速分析检测，为牛肉干食品的质量控制提供检测依据。

1 材料与方法

1.1 仪器和试剂

1.1.1 主要仪器与设备

超高效液相色谱仪（Agilent 1290）、三重串联四级杆质谱（Agilent 6470 QQQ，配有ESI源）（美国Agilent公司）；刀式研磨粉碎仪（GM200，德国Retsch公司）；电子天平（LT2002，常熟市天量仪器有限公司）；多管涡旋混合器（UMV-2，北京普立泰科仪器有限公司）；离心机（湖南湘仪离心机仪器有限公司）；涡旋混合器（XW-80A，上海米青科实业有限公司）；超纯水机（Milli-Q，美国Millipore公司）；Bond ElutQuEChERS分散SPE净化管（每支15 mL，50 mg PSA、150 mg C18、900 mg Na2SO4，美国Agilent公司）；0.22 μm PTFE滤膜（上海安普实验科技股份有限公司）。

1.1.2 主要试剂与材料

甲醇、乙腈（色谱纯，德国Merck公司）；乙腈（分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司）；甲酸（色谱纯，上海安普实验科技股份有限公司）；乙酸铵（优级纯，西亚试剂）；罗丹明B（纯度＞99%，德国Dr. Ehrenstorfer公司）。

1.2 标准溶液配制

精密称取10 mg（精确至0.1 mg）罗丹明B于10 mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容刻度，混匀，配制成浓度1 000 mg/L标准储备液，于-18 ℃保存6个月。移取100.0 μL标准储备液于10 mL容量瓶中，用乙腈定容，配制成10 mg/L的标准溶液。移取100.0 μL标准储备液于10 mL容量瓶中，用乙腈定容，配制成100 μg/L的标准溶液。从100 μg/L的标准溶液移取200.0 μL于10 mL容量瓶中，用乙腈定容，配制成2 μg/L的标准工作液，备用。

1.3 色谱条件

ZORBAX Eclipse Plus-C18反相色谱柱（50 mm×2.1 mm，1.8 μm，美国Agilent公司）；流动相A，0.1%甲酸水溶液；流动相B，乙腈；流速0.3 mL/min；柱温40 ℃；进样体积5.0 μL；梯度洗脱程序见表1。

1.4 质谱条件

离子源，电喷雾离子源（ESI），正离子扫描；多反应监测（MRM）；毛细管电压4.5 kV；雾化器压力45 psi；干燥气流速10 L/min；干燥气温度300 ℃；鞘气流速10 L/min；鞘气温度300 ℃；其他质谱条件见表2。

表1 流动相梯度洗脱程序

表2 质谱条件

1.5 样品前处理

称取2.00 g粉碎后的试样于50 mL聚四氟乙烯离心管中，准确加入10 mL乙腈溶液，以2 500 r/min涡旋振荡10 min，以4 500 r/min常温离心5 min。移取3 mL上清液于QuEChERS分散SPE净化管中，涡旋2 min，以4 500 r/min常温离心5 min。取上清液，过0.22 μm PTFE针式滤膜，待测。

2 结果与分析

2.1 样品前处理的优化

2.1.1 提取

对甲醇、乙腈、0.1%甲酸甲醇、0.1%甲酸乙腈、甲醇乙腈溶液（1∶1，V/V）、0.1%甲酸甲醇乙腈溶液（1∶1，V/V）、乙腈-水溶液（8∶2，V/V）、0.1%甲酸乙腈-水溶液（8∶2，V/V）不同提取溶剂进行考察。结果表明，使用甲醇和乙腈作为提取溶剂时，提取效果相当，提取率均大于90%，且优于其他几种提取溶剂；做实际样品测定时，使用甲醇作为提取溶剂，样品有假阳性结果出现，故选取乙腈作为提取溶剂。

考察涡旋振荡器与超声仪对提取效果的影响，结果表明，在相同提取时间内，使用涡旋震荡器进行提取时目标物提取率更高，故试验选取涡旋振荡器进行振荡提取。在此基础上，试验进一步优化涡旋振荡提取时间（5，10，15和20 min），结果表明，涡旋振荡提取10 min以上，随着涡旋振荡时间增加，目标物的提取效果趋于稳定，故选取涡旋振荡10 min进行样品提取。

2.1.2 净化

分别对QuEChERS分散SPE净化管、PSA/C18净化管及MCX固相萃取小柱净化效果进行了考察，结果见图1。结果表明，3种净化方法效果都较为理想，但使用MCX固相萃取小柱因处理过程繁琐、耗时较长，不适用大批量样品的快速处理；使用QuEChERS分散SPE净化管净化效略显优于PSA/C18净化管的净化效果，回收率均在90%以上，对目标物吸附很小，且处理简单快捷，适用于大批量样品的处理。故选取QuEChERS分散SPE净化管用作样品的净化。

图1 不同净化方法的净化效果

2.2 色谱条件的选择

试验采用超高效液相色谱，选取50 mm×1.8 μm的超高压色谱柱，与传统的色谱柱相比，可承受更高的压力，峰形更好，分析时间更短。此外，选择流速0.3 mL/min，对质谱部分有较好雾化效果，减少溶剂对质谱分析的影响。

流动相的选择一方面要考虑目标化合物的色谱分离情况，另一方面要考虑质谱分析条件。由于此次试验的提取溶剂和上机测定溶剂为乙腈，且目标物均易溶于乙腈，因此选用乙腈作为流动相B；试验发现，选择乙腈-0.1%甲酸水为流动相体系，在该条件下，目标物有较好的质谱响应，进一步对梯度洗脱程序进行优化，使目标物有较好分离，缩短样品分析时间，提高分析效率；试验对25，30，40和50 ℃不同柱温进行考察，结果表明，采用40 ℃柱温时，目标物分离效果较好，从而确立了最佳色谱条件，样品单次分析时间仅需3 min，满足大批样品的快速检测分析。

2.3 标准曲线、检出限与定量限

将1.2小节中配制出的标准工作溶液稀释至1/100，1/50，1/20，1/10，1/5，1/2和1倍，得到0.02，0.04，0.10，0.20，0.40，1.00和2.00 μg/L系列梯度混合溶液。以标准溶液的峰面积（Y）对其质量浓度（X，μg/L）绘制标准曲线，结果表明，罗丹明B在0.02～2.00 μg/L质量浓度范围内呈现良好的线性关系，相关系数（R2）为0.999 4，适用于定量分析。按照信噪比≥3（S/N≥3）对最低检测限（LOD）进行测定，定量限（LOQ）以最低检测限的3倍进行计算，结果见表3。

表3 罗丹明B的线性范围、线性方程、相关系数（R2）、检出限（LOD）和定量限（LOQ）

2.4 准确度和精密度

选取阴性牛肉干样品进行添加试验，验证该方法的准确度和精密度。分别添加0.2，0.4和1.0 μg/kg这3个不同浓度的添加水平，每个添加水平做6个平行，按照1.5小节的样品前处理方法进行提取净化，3个加标浓度连续做3 d，以考察方法的准确度和精密度，准确度以相对偏差表示，精密度以变异系数（C.V.）表示，计算加标回收率、日内变异系数和日间变异系数。标准溶液、空白样品和加标样品的色谱图见图2～图4，方法的准确度和精密度结果见表4。结果表明，目标分析物的准确度均小于10%，日内回收率在91.8%～101.4%之间，日内变异系数（C.V.）在1.6%～3.7%之间；日间回收率在90.7%～99.6%之间，日间变异系数（C.V.）在1.8%～3.1%之间。方法回收率高，准确度和精密度良好，能够满足牛肉干样品中罗丹明B残留量的测定。

2.5 方法的应用

应用建立的方法对购自市场上的60份牛肉干样品进行测定，每个样品平行测定2次，其中有1份样品罗丹明B检测结果呈阳性，检测结果为3.98 μg/kg，其余样品均未检出。

表4 罗丹明B的准确度和精密度

图2 罗丹明B标准溶液（1 μg/L）MRM色谱图

图3 牛肉干空白样品加标（1 μg/kg）MRM色谱图

图4 牛肉干空白样品MRM色谱图

3 结论

试验采用超高效液相色谱-串联质谱仪建立牛肉干中罗丹明B残留量的快速检测方法，对样品前处理方法、色谱、质谱等条件进行优化，确立以乙腈作为提取剂，用QuEChERS分散SPE净化管净化。结果表明，样品在3 min内完成分析，罗丹明B在0.02～2.00 μg/L质量浓度范围内，相关系数为0.999 4，检出限为0.1 μg/kg，在0.2，0.4和1 μg/kg这3个添加浓度水平，目标分析物的准确度均小于10%，日内回收率在91.8%～101.4%之间，日内变异系数在1.6%～3.7%之间；日间回收率在90.7%～99.6%之间，日间变异系数在1.8%～3.1%之间。方法具有操作简单、样品分析时间短、回收率高、准确度和精密度好等优点，能够准确定性和定量牛肉干中罗丹明B的痕量分析，适用于牛肉干中罗丹明B的快速筛查与确证，为牛肉干中罗丹明B残留量的检测提供技术支撑，为监管部门及食品安全提供更多的理论依据。

利用建立的方法对购自市场上的牛肉干样品进行检测，结果有1份样品检测出罗丹明B，检测结果为3.98 μg/kg，说明罗丹明B即使被列为禁止在食品中使用的工业染料，但还是有不法商贩在利益驱使下违法将罗丹明B代替食品着色剂使用，以次充好，对消费者健康产生较大安全风险，应引起监管部门重视。