多指标正交试验优化苦荬菜提取工艺及DPPH清除能力

荣荣，贾玉山，格根图，赵牧其尔，范美超，郝俊峰

内蒙古农业大学草原与资源环境学院（呼和浩特 010011）

蒙早苦荬菜（Lactuca indicaL. Meng zao）是菊科（Compositae）莴苣属（Lactuca）一年生或二年生草本植物。是内蒙古农牧学院草原系张秀芬[1]教授等经过很多年培育并选育出的苦荬菜新品种。近30年来，国内外研究者对同属植物进行了化学成分的研究，表明其主要含有黄酮类、萜类、甾醇类物质[2-3]。苦荬菜在民间常用于清热止咳化痰[4]，清热解毒[5]、抗炎杀菌[6]、抗氧化[7]、降血糖[8]等方面具有一定疗效。程梁华等[9]用超声萃取方法提取苦荬菜总黄酮成分。以及程艳刚等[10]响应面法优化苦荬菜总三萜提取工艺。杨树青等[7]从山苦菜提取总黄酮并提出具有一定的抗氧化活性。试验采用多指标-超声萃取方法结合正交试验[11-12]。基于以幼嫩期蒙早苦荬菜叶片为原料，以超声时间、温度、频率、料液比为因素，紫外-分光光度法[13]测定其含量。以总黄酮、总三萜、β-谷甾醇提取率总和为综合评价指标，使用L9(34)正交试验法设计优化蒙早苦荬菜活性物质的最佳提取条件。并对最佳工艺条件进行验证试验及测定对DPPH清除能力，为进一步开发利用以及探究它的经济价值提供有效的依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

蒙早苦荬菜，在内蒙古农业大学温室牧草栽培基地种植。

黄酮标准品，芦丁；三萜标准品，齐墩果酸；甾醇标准品，β-谷甾醇（上海源叶生物科技有限公司）；无水乙醇；亚硝酸钠；硝酸铝；氢氧化钠；甲醇；高氯酸；香草醛；冰醋酸；抗坏血酸（VC）；DPPH（1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼）；VOSHIN-1500C智能恒温型超声波萃取仪（无锡沃信仪器有限公司）；UV2300Ⅱ系列双光束紫外可见分光光度计。

1.2 测定方法

1.2.1 提取液制备

将幼嫩期新鲜苦荬菜取上叶片，在自然条件下晾干，之后过60目筛，准确称取1.00 g样品用70%乙醇稀释（根据正交试验料液比）、过滤、待测。

1.2.2 总黄酮的测定方法

将芦丁标准品于105 ℃烘干箱内干燥至恒质量，准确称取20.00 mg，配置浓度为70%乙醇[14]充分溶解定容至100 mL，得到质量浓度为0.20 mg/mL的芦丁标准溶液。准确吸取标准溶液0.00，1.00，2.00，3.00，4.00和5.00 mL置于50 mL的容量瓶，加入2.00 mL浓度为5%的NaNO2溶液，摇匀后静置10 min再加入2.0 mL浓度为10%的Al(NO3)3溶液，放置5 min后加入10.0 mL浓度为4%的NaOH溶液，最后用浓度为70%的乙醇定容，摇匀，以空白溶液为对照，立即用可见-紫外分光光度计在510 nm波长处测定，测定每个标准样的吸光度（A）[15]，以吸光度为纵坐标（Y），以标准样品浓度为横坐标（X）绘制标准曲线，计算线性回归方程。得到芦丁标准品浓度与吸光度关系的回归方程为：Y=0.061 3X+0.001 7，r2=0.999 9。

将不同料液比提取液取1 mL 于50 mL容量瓶中，余下的步骤与芦丁标准曲线的制备方法相同[16]。测得吸光度，代入标准曲线的回归方程，计算黄酮的含量。

1.2.3 总三萜测定方法

将105 ℃下进行充分干燥的齐墩果酸对照品精密称取25 mg，用甲醇溶解稀释至25 mL容量瓶中，摇匀使完全溶解，配制成质量浓度为1.0 mg/mL的对照品溶液备用。分别精取质量浓度为1.0 mg/mL的齐墩果酸对照品溶液0，0.2，0.4，0.6，0.8和1 mL，置于干燥洁净的试管中，放置室温下完全挥尽溶剂后，于每支试管中加入高氯酸溶液1.6 mL、5%香草醛-冰醋酸溶液0.4 mL，置于70 ℃水浴上加热15 min，自然放冷后，加入冰醋酸5 mL，摇匀[17]。在可见-紫外分光光度计于548 nm 波长处测定不同浓度对照品溶液的吸光度，并进行空白试验。以齐墩果酸的不同浓度为横坐标，吸收度A为纵坐标，绘制其标准曲线。得到标准曲线方程为y=0.086 2x+0.001 2，r2=0.999 9。

精密量取1 mL提取液用10 mL氯仿洗涤3次。于水浴上蒸干，加入5 mL甲醇溶液，于水浴上加热并充分溶解，室温放冷后转移至10 mL 容量瓶中，再加入甲醇溶液至刻度，混匀[18]。精密吸取上述溶液100 μL，计算齐墩果酸含量。

1.2.4β-谷甾醇测定方法

准确称取干燥至恒质量的β-谷甾醇25.00 mg，用无水乙醇溶解，定容至25 mL，配置质量浓度为1.0 mg/mL标准品溶液。分别取0，20，40，60，80和100 mL的β-谷甾醇标准液置于具塞试管中，60 ℃恒温水浴挥干溶剂，各加5%香草醛-冰乙酸溶液0.2 mL、高氯酸0.8 mL，摇匀、密塞，60 ℃恒温水浴15 min，立即取出流水冷却，加冰乙酸5 mL，摇匀，室温静置40 min后，以不加样品的平行样作为空白，应用可见-紫外分光光度计在545 nm波长处测定吸光度[19]，以β-谷甾醇浓度为横坐标，吸光度（A）为纵坐标，作回归曲线。回归方程：Y=0.230 8X+0.005 1，r2=0.999 9。

取1 mL提取液置于具塞试管中，60 ℃恒温水浴挥干溶剂，加5%香草醛-冰乙酸溶液1 mL、高氯酸0.8 mL，摇匀、密塞，60 ℃恒温水浴15 min，立即取出流水冷却，加冰乙酸5 mL，摇匀，室温静置40 min后，测定吸光度。

1.3 试验设计

1.3.1 正交试验设计

在参考文献[20]的基础上，以超声时间（A）、超声温度（B）、超声频率（C）、料液比（D）为四因素，每个因素设置三个水平进行正交试验。优化超声萃取条件下总黄酮、总三萜、甾醇含量的变化以及提取最适条件。见表1。基于L9(34)正交试验将苦荬菜总黄酮提取率、总三萜提取率、β-谷甾醇提取率进行综合评分，评分时以各指标的最大值为参考值，将数据进行归一化后设定不同权重。总黄酮提取率、总三萜提取率、β-谷甾醇提取率权重分别为0.35，0.25和0.4。利用综合评分值正交试验结果进行方差分析。正交试验结果见表2，方差分析结果表3。

表1 L9(34)正交试验因素及水平

1.3.2 验证试验设计

根据多指标综合评分正交试验结果，称取1.00 g粉碎样品，根据最佳提取条件超声萃取，平行试验提取3次，按1.2.2、1.2.3、1.2.4方法测定。结果见表4。

1.3.3 DPPH清除能力的测定

将苦荬菜叶片粉样分别取0.4，0.6，0.8，1.0和1.2 mg，按最佳提取条件提取备用。其中分别加入2 mL 0.16 mmol/L DPPH的乙醇溶液并混匀，室温避光放置50 min，用分光光度计在517 nm波长处测定吸光度（无水乙醇为空白）[21]，以VC溶液作为阳性对照，每个样品做3个重复，清除率计算公式如下[22-23]：

式中：Ai为2 mL样品溶液+2 mL DPPH溶液的吸光度；Aj为2 mL样品溶液+2 mL无水乙醇的吸光度；Ac为2 mL无水乙醇+2 mL DPPH溶液的吸光度。

1.4 数据处理

在Excel数据统计基础上结合SAS软件进行数据分析，试验每个处理均3次重复。

2 结果与分析

2.1 正交试验结果

正交试验结果见表2和表3。

根据表3综合评分方差分析F值大小可知影响因素大小为D＞C＞A＞B。其最大影响因素为料液比（D），随着料液比的增加综合提取率有增加趋势。根据p值，料液比（D）为极显著差异（p＜0.000 1），超声时间（A）与频率（C）为差异高度显著（p＜0.01），温度（B）与其他相比差异显著（p＜0.05）。根据表2试验结果，综合评分值最大为92.70%，其相应提取条件是A1B3C3D3。而根据K值，最佳提取条件为A2B3C1D3，即提取时间（A）为40 min，温度（B）为60 ℃，频率（C）为40 kHz，料液比（D）为1∶300 g/mL，为进一步探索最佳提取条件，进行下一步验证试验。

表2 正交试验结果

表3 综合评分方差分析

2.2 验证试验结果

根据正交试验得出的最佳提取条件下进行验证试验。见表4，最佳提取条件下黄酮提取率为4.235%、总三萜提取率为2.960%、β-谷甾醇提取率为8.028%，综合评分值为99.11%，其RSD为0.34%，表明正交试验提取结果符合实际检验结果，具有可靠性。这与屠万倩等[24]研究结果一致。

表4 验证试验结果

2.3 苦荬菜活性提取液DPPH清除能力

由图1可知，在质量浓度2～1.2 mg/L范围内，苦荬菜提取液和VC对DPPH的清除能力随着浓度的增加清除能力不断增加，趋于平缓直线。综合来看，苦荬菜提取物具有良好的DPPH·清除能力。计算得出，IC50分别为IC50（VC）=0.006 mg/mL，IC50（苦荬菜提取液）=0.17 mg/mL。表明苦荬菜提取液DPPH清除能力比VC较弱。但根据综合评分值来看，苦荬菜具有较好的抗氧化能力，这与太文杰等[11]研究结果一致。

图1 苦荬菜活性提取液物对DPPH自由基清除能力

3 结论

以蒙早苦荬菜为原料，基于多指标正交试验以超声时间、超声温度、超声频率、料液比为四因素进行超声萃取，苦荬菜主要活性物质总黄酮、总三萜、β-谷甾醇提取率合为综合指标，设计L9(34)正交试验探索苦荬菜超声萃取最佳提取条件及抗氧化能力。根据试验正交试验综合评分值确定超声提取最佳条件为A2B3C1D3，即提取时间（A）为40 min，温度（B）为60 ℃，频率（C）为40 kHz，料液比（D）为1∶300 g/mL。综合评分值达到99.11%。其根据验证试验结果得出正交试验具有一定的可靠性。在此基础上，分析苦荬菜提取液的综合评分值及DPPH清除能力，结果显示，苦荬菜具有较强的DPPH清除能力。通过试验，得出多指标超声萃取蒙早苦荬菜主要活性物质具有一定的研究意义，为继续开发研究蒙早苦荬菜活性物质提供良好的基础。