脊索瘤的超微结构特点及临床研究

张 琪 汪 颖

(北京市神经外科研究所电镜室 首都医科大学附属北京天坛医院，北京 100070)

脊索瘤是一种较为少见的低中度恶性原发性骨肿瘤，起源于胚胎残余脊索组织[1]。男性略多于女性，发病年龄不等，尤30岁以后发病多见。脊索瘤以局部侵袭性及高复发性为特点，治疗上以手术治疗为主，对传统的放化疗均不敏感。患者术后肿瘤复发率相对较高，预后也较差。颅底脊索瘤好发于斜坡区，常以颅神经损害(其中以动眼神经和外展神经症状多见)脑积水和运动感觉障碍起病，因起病隐匿，无典型症状而导致诊断延迟。本研究从形态学角度分析，对脊索瘤的组织形态及超微结构进行观察，从而辅助脊索瘤的临床诊断，进一步指导临床合理制订治疗方案，并判断预后。

1 资料与方法

1.1 临床资料

收集首都医科大学附属北京天坛医院北京市神经外科研究所超微形态室2012年至2019年间诊断为脊索瘤的241例患者，其中男性141例(59%)，女性100例(41%)。年龄发生在3～80岁，平均年龄为43岁。241例标本中有227例经典型脊索瘤，14例软骨样脊索瘤。患者首诊的主要临床表现为头痛及复视，其他症状还包括吞咽困难、饮水呛咳、言语不清、构音不良、视物模糊、行走不稳及面神经瘫痪等。神经学检查为多组脑神经受累的相应体征，如眼球运动受限、水平眼震、突眼、舌肌萎缩、舌肌纤颤、浅感觉减退、眼睑下垂和咽反射迟钝等。

1.2 标本制备及仪器

电镜标本制备：将手术中切除的脊索瘤标本即刻置入2%多聚甲醛-2.5%戊二醛固定液中固定，0.1 mol/L二甲砷酸钠缓冲液(pH=7.4)冲洗；再经1%四氧化锇后固定，双蒸水冲洗后，梯度乙醇脱水至环氧丙烷，SPI812树脂包埋；使用Leica EM UC7切片机制备1μ半薄切片，天青-美蓝染色光学显微镜观察定位后，Leica EM UC7切片机制备60nm超薄切片，醋酸双氧铀、枸橼酸铅染色，HITACHI H-7650型透射电子显微镜观察、拍片。

1.3 结果判定

每例标本分别观察肿瘤细胞的形态结构，瘤细胞核内染色质分布，瘤细胞膜表面突起及细胞间连接，瘤细胞胞质内粗面内质网，线粒体等细胞器分布，细胞间质有无絮状无定形结构。

2 结果

2.1 临床资料

本组241例患者，男141例，女100例，男女比例约为1.41∶1。年龄范围在3～80岁，平均43岁。病程1月～7年。临床主要表现为头痛，复视，面神经瘫痪等。241例患者均行CT(SENSATION, Siemens, 德国)或MRI (Tiro3.0T, Prisma, Siemens, 德国)影像学检查，病变部位累及斜坡者占85%(206/241)，表明颅底脊索瘤发病的典型位置。颅底由于结构相对复杂，颅底脊索瘤一般生长缓慢，较易侵犯邻近颅底的重要结构，手术完全切除的难度相对较大，且容易残留引起肿瘤复发。本组241例中46例仅局限于斜坡区(19%)，余195例均伴有周围组织结构的侵犯和不同程序的组织破坏(81%)，显示了脊索瘤较易影响周围结构的这一特征。

头部平扫+增强MRI检查结果如图1所示，右额鞍背，斜坡骨质破坏，术区信号混杂，局部可见梭形混杂密度，斜坡，鞍区可见团块状混杂信号影，边缘不清(见图1A)，左侧基底节区可见片状长T1和长T2信号(箭头所示长T2信号)，边缘模糊，增强可见中度不均匀强化(见图1B)。

图1 头颅MRI检查影像

2.2 病理形态及免疫组织化学特征

241例脊索瘤组织均行天青-美兰半薄切片染色和免疫组织化学染色。按照瘤细胞的分布程度，光镜(Leica DM4000)下观察到的脊索瘤分为密集型和稀疏型两种，密集型脊索瘤瘤细胞排列紧密，细胞数量较多，细胞之间未见絮状无定形物质，细胞核形态相对规则，多呈圆形或椭圆形，核仁大且明显，双核仁多见，偶见瘤细胞胞质内空泡状物质，间质散在血管结构(见图2A～图2B)。稀疏型脊索瘤瘤细胞分布较稀疏，胞质内可见大小不一的空泡将胞核挤至细胞一侧，胞核形态不规则，胞膜表面突起丰富(见图2C)，部分瘤组织内可见钙化灶及大量炎细胞浸润(见图2D)。特殊染色PAS,alcian blue(阿辛蓝)着色，瘤细胞胞浆和细胞外基质均阳性表达。表1显示241例脊索瘤标本均进行免疫组织化学染色，胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)，低分子细胞角蛋白(CAM5.2), 神经元特异性烯醇化酶(NSE)均呈阴性表达，增殖细胞相关核抗原(Ki-67)增殖指数为10%～20%。其中227例经典型脊索瘤组织中细胞角蛋白(CK)表达阳性者227例，上皮膜抗原(EMA)表达阳性者210例，波形蛋白(Vimentin)表达阳性者224例， S-100表达阳性者192例，胚胎核转录蛋白(Brachyury)表达阳性者225例，另外14例软骨样脊索瘤组织中CK表达阳性者14例，EMA表达阳性者11例， Vimentin表达阳性者14例， S-100表达阳性者14例， Brachyury表达阳性者14例。

图2 脊索瘤病理形态

表1 脊索瘤免疫组织化学染色阳性结果 例

2.3 透射电镜观察

241例脊索瘤临床样本进行电镜下观察，其中经典型脊索瘤227例，软骨样脊索瘤14例。经典型脊索瘤患者中大部分组织瘤细胞稀疏分布(见图3A～图3F)，另外一部分患者组织中瘤细胞分布相对密集(见图3G～图3I)。稀疏分布的瘤组织中瘤细胞比较大，形态不规则(见图3A)，细胞核常被黏液泡挤至一侧呈偏位，细胞核形态不规则，核仁明显，细胞膜表面可见微绒毛样细长或短小粗钝的突起(见图3B)，细胞质内可见大小不等的空泡和微丝样结构，空泡内可见纤维状物或无定形絮状蛋白样物质，相邻细胞膜之间可见不典型的桥粒连接(见图3C)，沿细胞膜表面有大量吞饮小泡(见图3D)，部分瘤细胞质内散在糖原颗粒。瘤细胞胞质内可见典型的粗面内质网包绕线粒体(线粒体-RER)形成的特征性结构(见图3E)，间质散在大量絮状无定形物质(见图3F)。分布相对密集的瘤组织内瘤细胞核大浆少，胞核异型，部分组织中散在大量炎细胞浸润(见图3G)，胞质内可见线粒体-RER典型结构(见图3H)和大量微丝(见图3I)。软骨样脊索瘤样本中少部分患者瘤细胞分布相对密集，大部分稀疏分布，在细胞膜表面无特殊的细胞间连接，仅存在少量微绒毛样短小突起(见图4A)，胞质内见大量糖原及微丝(见图4B)，此型组织除了线粒体-RER结构外(见图4C)，还可观察到粗面内质网池内存在微管样结构(见图4D)，这是软骨样脊索瘤电镜下的主要超微结构特点。

图3 经典型脊索瘤

图4 软骨样脊索瘤

3 讨论

脊索瘤是罕见的原始脊索残余发生的恶性肿瘤，仅占骨原发恶性肿瘤的4%，几乎只发生在中轴部位，尤其是脊柱的两端。脊索瘤依据肿瘤细胞分化程度和形态学特点分为3个亚型：经典型，软骨型，去分化型。目前对脊索瘤发生机制的认识尚有限[1,2]。研究报道，男性患者较常见，发病部位与脊索残存部位有关，易发生于脊柱两端，但较少发生于鼻咽部及颈椎[3,4]。本组病例主要以男性患者及颅底部位发病为主。经典型较多见，占227例，光镜下肿瘤呈分叶状，瘤细胞呈条索状排列，胞质内有大小不一的空泡，呈典型的“液滴样”细胞，核分裂影像较少见，背景为黏液样基质。软骨样脊索瘤14例，在瘤组织内既有经典型脊索瘤的结构，又有向软骨方向分化的表现，易误诊为软骨肉瘤，这是一种特殊类型的脊索瘤，占脊索瘤的5%～15%。本组病例未收集分化型脊索瘤。分化型较少见，占脊索瘤比例<10%，除了经典型脊索瘤形态特点外，局灶还会出现低分化肉瘤样区域以及不同成分之间的移行区，侵袭性强，预后差。

脊索瘤诊断需要综合考虑患者的病史、症状、体征、辅助检查以及术后病理等进行判断[5]。虽然临床上初步诊断主要依靠影像学诊断(CT /MRI)，但最终确诊还需要通过肿瘤切除术或活检术获取标本进行病理学诊断加以明确[6]。光镜、免疫组化及电镜三个方面对于脊索瘤的诊断、疗效及预后判定是互补的, 单纯依靠光镜和免疫组化, 资料有限，需要电镜观察超微结构进行协助；单纯依靠电镜难以避免以点盖面的不足，实际工作中需结合常规光镜病理观察，提供更为完整的肿瘤形态学资料。

脊索瘤患者的临床症状与其发生部位存在密切关系，主要症状为病灶部位疼痛及神经功能障碍或缺损。本组241例患者就诊的主要临床表现包括无诱因头晕或头疼、视力下降，行走不稳，饮水呛咳，间歇性吞咽困难，发作性抽搐，周围组织麻木、大小便潴留、鼻塞及鼻出血，结合影像学检查确定发病部位，当患者出现上述症状，应高度怀疑脊索瘤的可能性。

X片、CT及MRI检查是目前的主要影像学检查手段，其中CT与MRI是目前主要的参考手段，尤其是MRI检查，参考价值较大[7-9]。本组241例患者中46例仅局限于斜坡区(19%)，余195例均伴有周围组织结构的侵犯和不同程序的组织破坏(81%)，显示了脊索瘤较易影响周围结构的这一特征。但有文献报道，病理与影像学检查的相符率仅有50%，提示影像学检查诊断该病存在局限性[10，11]。

病理学诊断是脊索瘤诊断的“金标准”。 对脊索瘤进行分子生物学标记是现代诊断病理学的重要步骤之一，同时必须清楚现有生物学标志物并不是特异或专门针对某一种类肿瘤。细胞角蛋白(cytokeratin CK)主要分布于上皮细胞，是角质细胞中的主要骨架蛋白，这种结构蛋白主要维持上皮组织的完整性及连续性，阳性表达于上皮细胞，间质细胞[12]。上皮膜抗原(epithelial membrane antigen, EMA)广泛分布于各种上皮细胞及其来源的肿瘤中，分布范围与细胞角蛋白相似，用于研究上皮及上皮源性肿瘤[13]。波形蛋白(Vimentin)是中间丝的其中一种蛋白质，组成细胞骨架，参与微管及肌动蛋白微细丝形成，是间叶组织标志[14]。 胶质原纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)是胶质细胞特有的一种中间丝蛋白，广泛分布于星形胶质细胞质和突起内，其阳性表达在具有向星形胶质细胞分化特征的胶质瘤及60%～70%的少枝胶质细胞瘤[15]。S-100蛋白是一种酸性钙结合蛋白，主要存在于中枢神经系统各部的星状神经胶质细胞胞质中[16]。

本组241例肿瘤均行免疫组织化学染色，结果显示241例中GFAP蛋白均阴性表达，20例EMA阴性表达，3例Vimentin阴性表达，35例S-100阴性表达，仅2例Brachyury阴性表达，Ki-67增殖指数为10%～20%，余均表达阳性。由于和脊索瘤组织学相似的肿瘤类型有很多，而免疫组化抗体Vimentin、CK、EMA、S-100及Ki-67特异性并不高，使得脊索瘤的误诊率较高。Brachyury基因是近年来发现对脊索瘤高度敏感和特异的基因，2013版WHO骨与软组织肿瘤分类中明确提出Brachyury抗体可以辅助脊索瘤诊断，该项免疫组化检测已经常规应用于临床诊断工作中[17]。尽管有文献已经报道，作为诊断脊索瘤的一线抗体，Brachyury的敏感性和特异性均较好，但也存在部分患者Brachyury阴性表达的可能性[18，19]，因此，利用电镜技术更容易对部分脊索瘤类型进行定性，进而辅助疾病的诊断。

进一步对241例脊索瘤进行超微结构诊断，经典型脊索瘤227例中62例瘤细胞呈密集分布，165例呈稀疏分布，软骨样脊索瘤14例中2例呈密集分布，12例呈稀疏分布。通过观察肿瘤超微结构发现，稀疏分布的瘤细胞体积较大，胞核形态不规则，细胞核常被黏液泡挤至一侧呈偏位，细胞膜表面可见微绒毛样细长或短小粗钝的突起，细胞质内可见大小不等的空泡和微丝样结构，空泡内可见纤维状物或无定形絮状蛋白样物质，相邻细胞膜之间可见不典型的桥粒连接，表明其具有上皮性质。沿细胞膜表面有大量吞饮小泡，部分瘤细胞质内散在糖原颗粒，最典型的特征性结构是粗面内质网包绕线粒体形成的“线粒体-RER”结构。密集分布的瘤细胞呈核大浆少，部分组织中散在炎细胞浸润，也可见“线粒体-RER”典型结构。软骨样脊索瘤瘤细胞膜表面无特殊的细胞间连接，仅存在少量微绒毛样短小突起，胞质内也可见大量糖原及微丝，除了“线粒体-RER”结构外，还可观察到粗面内质网池内存在微管样结构，这是电镜下区别软骨样脊索瘤与经典型脊索瘤的最主要特征。研究已经证实，软骨样脊索瘤较普通型脊索瘤预后好[6, 20，21]，因此电镜下区别两型肿瘤，有利于评估患者愈后情况。

综上所述，脊索瘤为低度恶性的局部侵袭性肿瘤，好发于颅底、骶骨及脊柱，目前临床上完全切除难度较高，且复发率较高。患者诊断主要结合病史、症状、体征、影像学特征、病理形态，免疫组织化学染色和超微结构特征，治疗以手术切除为主，术后辅以放疗等综合治疗。形态学检查中光镜、免疫组化及电镜三者在脊索瘤的基础研究、诊断、疗效与副反应观察及预后判定中的作用是互补的。

透射电镜下观察脊索瘤超微形态能够更加直观的区别肿瘤的不同分型，弥补光镜病理诊断的不足之处，从而更好的辅助脊索瘤的临床诊断，评估患者愈后。