脊索瘤分子调控机制的研究进展

梁辰，杨辰龙，刘晓光

0 引言

脊索瘤是起源于胚胎残余脊索组织的原发肿瘤，国外数据统计其发病率约为百万分之一，占恶性骨肿瘤的1%～4%。肖建如等曾对近十年华东地区3个大型数据库中的1 209例原发性骨肿瘤数据进行分析，结果显示脊索瘤在恶性骨肿瘤中所占比例高达9.8%。该肿瘤发病年龄在50～60岁，男性多于女性，儿童罕见。组织学上，脊索瘤分为经典型，软骨型及去分化型，以经典型为主。发生部位以中轴骨、骶骨最多，其次是颅底及脊柱其他节段[1-2]。脊索瘤为低、中度恶性肿瘤，生长缓慢，起病隐匿，症状不典型，确诊时多数肿瘤体积较大，且临近结构复杂，手术切除难度高。脊索瘤对化疗不敏感，对放疗部分敏感，目前手术切除配合放疗是治疗脊索瘤的常规手段。然而，脊索瘤术后复发率较高，中位生存期6～7年，5年生存率约为65%，10年生存率约为35%[3]。虽然肿瘤的多模式治疗发展迅速，然而脊索瘤的治疗仍是困扰临床医生的难题。既往研究表明，脊索瘤的发生发展具有复杂的调控机制。近年来，有关脊索瘤分子生物学研究逐渐深入，包括Brachyury在内的多个分子、信号通路及microRNA被相继发现，脊索瘤相关靶向治疗也取得一定进展。本文主要对脊索瘤发生发展过程中关键分子、信号通路及表观遗传学等方面的最新研究进展进行综述。

关键分子及信号通路的选择，主要是将肿瘤发生的经典途径与脊索瘤的自身特点相结合，选取与脊索瘤发生高度相关的分子及信号通路进行阐述。其中，由于脊索瘤起源于胚胎残余脊索组织，所以本文重点选取了与胚胎发育异常相关的基因及通路。此外，本文选取了与细胞周期相关及肿瘤干细胞相关的关键分子。最后，对表观遗传学在脊索瘤研究中的最新进展进行了阐述。

1 关键分子

1.1 胚胎相关分子

Brachyury基因，是T-box基因家族中的一员，位于6q27区域，编码转录因子Brachyury蛋白，在胚胎发育过程中调控中胚层向脊索分化。Brachyury是近年来研究较为深入的脊索瘤标志物，其在脊索瘤诊断中具有重要价值。

目前，体外研究已证实Brachyury是脊索瘤发生的关键分子。在脊索瘤细胞系中敲低Brachyury后，细胞增殖受到显著抑制，细胞向衰老表型发展。最新研究发现，Brachyury基因及其上下游信号通路参与脊索瘤的恶性形成。在颅底脊索瘤中，激活PI3K/Akt通路可上调Brachyury的基因表达，且该通路抑制剂可显著抑制脊索瘤细胞的生长[4]。Shah等[5]发现Brachyury-YAP通路在调控脊索瘤的多能性及侵袭性方面具有重要作用。在分子诊断及预测脊索瘤预后方面，虽然Brachyury是公认的标志物，但是其表达量高低与肿瘤预后的相关性仍存在争议。最新的高通量测序及基因组学研究发现，Brachyury基因拷贝数目及SNP位点与脊索瘤预后可能存在一定相关性。Kelley等[6]前期研究表明Brachyury基因拷贝数增加是家族性脊索瘤重要的易感因素，SNP位点rs1056048及rs3816300可能与脊索瘤发病相关。Wang等[7]研究了Brachyury基因3种异构体在脊索瘤及脊索组织中的表达情况，脊索瘤组织及细胞系中长异构体表达水平最高，而长/短异构体比例在脊索瘤和脊索组织中存在明显差异。异构体差异表达是否影响脊索瘤发生发展，可能成为今后研究Brachyury基因的一个方向。

目前，脊索瘤中Brachyury基因上下游分子机制相关研究仍处于初始阶段，生物信息学预测的信号通路有待于进一步验证。构建以Brachyury为中心的网络，寻找治疗脊索瘤的有效靶点，开发应用小分子抑制剂进行治疗，可能成为脊索瘤治疗的新途径。

1.2 细胞周期相关分子

1.2.1 P53及相关蛋白 P53是维持细胞正常功能的重要调控者，当出现DNA损伤时，P53基因通过调控细胞周期阻滞及凋亡发挥抑癌作用。作为研究最为广泛的抑癌基因，超过50%的肿瘤中可见P53变异。然而，脊索瘤中有关P53基因遗传变异的研究较少，而关于P53蛋白表达水平的报道也不尽相同。早期研究表明，脊索瘤中P53表达水平与预后之间无显著相关性，P53基因在脊索瘤中无变异表现。也有研究报道，P53蛋白在脊索瘤中高表达且与患者预后不良相关。Yakkioui等[8]对25例脊索瘤标本中细胞周期相关标志物进行免疫组织化学染色，P53阳性占28%，且P53表达水平与脊索瘤细胞增殖能力及患者预后不良相关。

P53蛋白在脊索瘤中的表达水平及其与预后的相关性，需要进一步加大样本量进行检测及数据分析。p53基因作为公认的抑癌基因，在脊索瘤中未有变异发生，且表达水平增高与临床预后不良相关，提示可能存在抑制P53蛋白功能的机制，从而抑制P53对脊索瘤发生发展的调控。

鼠双微基因2（mouse double murine 2,MDM2）是一种原癌蛋白，可与P53蛋白结合，抑制P53介导的反式转录激活，并通过泛素化修饰导致P53降解，抑制其功能。MDM2基因扩增可在7%的肿瘤中检测到，而在未检测出该基因扩增的肿瘤中MDM2蛋白表达明显增多[9]。有研究报道，15%的脊索瘤中存在MDM2基因扩增。在脊索瘤中，P53的表达水平降低与MDM2过表达显著相关，也提示MDM2通过抑制P53蛋白功能，促进脊索瘤的生长[10]。

P53凋亡刺激蛋白（ASPP）是通过与P53蛋白家族相互作用，调控P53家族细胞凋亡诱导功能的一类蛋白。P53凋亡刺激蛋白抑制因子（inhibitor of apoptosis stimulating protein of p53, iASPP）是ASPP家族的一员，在多种肿瘤中呈过表达状态。Ma等[11]研究表明，在脊索瘤中，iASPP高表达，且表达水平与预后不良显著相关，iASPP可促进脊索瘤的增殖、侵袭，敲低iASPP表达可以增加脊索瘤对顺铂的敏感度。

在脊索瘤中，是否存在其他抑制P53功能的蛋白、MDM2影响脊索瘤生物学功能的机制及iASPP对脊索瘤的其他作用，有待于进一步深入研究。

1.2.2 CDKN2A P16蛋白是由CDKN2A基因编码，调控细胞周期的重要蛋白。P16主要通过阻止CDK4/cyclinD1复合体形成、抑制RB蛋白磷酸化，将细胞周期阻滞于G1期。P16是一种公认的抑癌蛋白，在多种肿瘤中低表达。早期研究报道称，CDKN2A基因在70%脊索瘤中出现同源或杂合缺失，该基因失活可能在脊索瘤发生中发挥重要作用。Liu等[12]研究发现，与软骨相比，脊索瘤中P16表达明显降低，且表达水平与肿瘤的侵袭呈负相关。Choy等[13]发现脊索瘤中CDKN2A基因位点变异导致拷贝数减少，进一步提示CDKN2A与脊索瘤发生显著相关。

1.3 肿瘤干细胞相关分子

肿瘤干细胞（cancer stem cell, CSC）是具有自我更新和多向分化功能的肿瘤细胞，在肿瘤生长、侵袭、复发等方面具有重要作用。干细胞的标志物主要包括c-myc、SSEA-1、Oct4、Klf4、Sox2、Nanog等。早期研究发现干细胞标志物在脊索瘤组织及细胞系中均表达，检测肿瘤干细胞是预测脊索瘤复发及转移的重要途径。Sox9基因在胚胎发育、器官发生、软骨分化及干细胞属性等方面具有重要作用。Chen等[14]研究发现Sox9基因在脊索瘤中高表达，且表达水平与脊索瘤预后不良相关。Sox9敲低后，不仅抑制了脊索瘤的生长和侵袭，促进凋亡、导致细胞周期阻滞，还可引起干细胞标志物Nanog、c-myc的表达降低，提示Sox9可作为脊索瘤诊断及治疗的靶点。寻找影响脊索瘤中肿瘤干细胞表型的分子，通过抑制肿瘤干细胞活性治疗脊索瘤，可能成为今后研究的方向。

1.4 其他分子

SMARCB1基因又名INI1/SNF5，编码INI1蛋白，被认为是抑癌基因。该基因在非典型畸胎瘤及横纹肌肉瘤中缺失。Li等[15]研究表明，SNF5低表达与颅底脊索瘤预后不良相关。Antonelli等[16]最新报道，8例儿童脊索瘤病例中，4例出现SMARCB1/INI1表达缺失，并发现3个新致病突变位点，提示该基因与儿童脊索瘤相关。Owosho等[17]发现在去分化脊索瘤中，存在大量SMARCB1/INI1表达缺失。Cha等[18]报道了2例去分化儿童脊索瘤病例SMARCB1/INI1阴性表达，其中1例存在SMARCB1/INI1基因缺失。去分化脊索瘤罕见，主要侵犯儿童，预后较差，SMARCB1/INI1基因与去分化脊索瘤高度相关，需进一步研究该基因缺失影响去分化脊索瘤发生的具体机制，寻找治疗去分化脊索瘤的有效方法。

2 信号通路

2.1 受体酪氨酸激酶相关通路

受体酪氨酸激酶相关信号通路是细胞内外信号转导的重要途径，有助于维持正常细胞功能，同时也介导多种恶性肿瘤的发生发展。受体酪氨酸激酶主要包括表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor, EGFR）家族、血小板生长因子受体（platelet derived growth factor receptor, PDGFR-β）家族、肝细胞生长因子受体（hepatocyte growth factor receptor, HGFR）等。脊索瘤中，EGFR等多个受体酪氨酸激酶表达增高，PI3K/Akt/mTOR等多条信号通路处于激活状态，与脊索瘤发生关系密切。

EGFR是调控细胞生长分化的重要跨膜受体蛋白，与肿瘤的不良预后、化疗及放疗耐受等紧密相关。EGFR是脊索瘤中激活最为显著的受体酪氨酸激酶，早期研究发现EGFR促进脊索瘤发生发展，应用EGFR抑制剂治疗脊索瘤的部分药物已进入Ⅱ期临床试验，但是长期疗效有待进一步观察。Scheipl等[19]在3株脊索瘤细胞系中进行了1 097个化合物疗效的筛选，其中EGFR抑制剂sapitinib疗效最为显著。Magnaghi等[20]研究了EGFR抑制剂对肿瘤细胞增殖的抑制作用，发现阿法替尼是唯一对所有脊索瘤细胞系均具有明显抑癌作用的EGFR抑制剂，为阿法替尼进入临床试验提供了理论依据。Tosuner等[21]研究发现，编码HGFR的c-MET基因与脊索瘤复发相关，可作为判断预后的标志物。

PI3K/Akt/mTOR通路是受体酪氨酸激酶相关的重要通路，该通路的激活与肿瘤发生相关，抑癌蛋白PTEN是该通路的负向调控者。Chen等[22]探讨了骶骨脊索瘤中PTEN和mTOR的表达水平与预后的相关性，发现两者表达与肿瘤的局部侵袭相关，可作为脊索瘤治疗的潜在靶点。Wu等[23]对颅底脊索瘤骨侵袭的蛋白质组学研究表明，PTEN与骨侵袭的程度相关，PI3K/Akt/mTOR通路也与骨侵袭相关。

Hu等[24]研究发现另一条重要的受体酪氨酸激酶通路FGFR/MEK/ERK可以与Brachyury作用，预测该通路可以作为治疗脊索瘤的新靶点。总的来说，虽然与脊索瘤相关受体酪氨酸激酶较多，但是针对脊索瘤治疗的有效靶点仍然欠缺，构建RTKs与Brachyury等分子之间的信号网络，研发针对多个靶点及通路的复合药物，可能成为改善脊索瘤化疗耐受的重要方式。

2.2 Sonic Hedgehog（SHH）通路

Hedgehog基因最早是在果蝇中发现的，因其突变导致果蝇胚胎覆盖尖齿，形似刺猬而得名。Hedgehog家族主要包括：SHH、Desert Hedgehog和Indian Hedgehog。Hedgehog通路不仅在人胚胎发生中起重要作用，而且在多种肿瘤中激活，然而在脊索瘤中相关研究较少。SHH是Hedgehog家族中研究最为广泛的分子，被认为参与椎体的发育[3]。SHH是SHH通路的启动子，SHH与其受体PTCH1结合后，解除了PTCH1对蛋白的抑制，激活下游效应分子Gli1、Gli2、Gli3等[25]。Cates等[26]研究发现，在一组28例脊索瘤标本中，96%存在SHH高表达，82%存在PTCH1受体的阳性表达，而PTCH1受体正是SHH的下游分子。在脊索瘤中，尚缺乏SHH通路其他下游分子，如SMO、Gli1、GLli2、Gli3等的研究，SHH是否能够成为脊索瘤的治疗靶点，还有待于进一步探讨。

2.3 Wnt通路

大量研究表明，Wnt通路参与多种肿瘤的发生发展。β-cantenin是Wnt通路中的关键分子，其在胞核内积聚是肿瘤细胞发生的重要表现。个体发育过程中，Wnt通路在维持脊索功能中具有重要作用，通过干扰β-cantenin阻断Wnt通路后，脊索功能发生障碍。有关细胞黏附分子在脊索瘤中表达的研究发现，β-cantenin与脊索瘤的组织结构形成及维持相关，可能作为脊索瘤诊断的标志物。早期针对细胞黏附分子的1项16例脊索瘤研究发现，37.5%存在β-cantenin膜表达。Chen等[27]的最新研究发现，在脊索瘤中microRNA185-5p可以通过Wnt信号通路发挥作用。以上研究结果提示，Wnt通路可能在脊索瘤发生发展中扮演重要角色，需深入研究Wnt通路中关键分子的表达水平及调控作用。

3 表观遗传学

表观遗传学是指在不改变基因序列的基础上，通过DNA甲基化及非编码RNA等修饰改变基因表达的过程。近年来，表观遗传学研究是肿瘤学研究的热点领域。

3.1 DNA甲基化

DNA甲基化是不改变DNA序列，通过甲基化进行DNA化学修饰。目前研究表明，特定基因的DNA甲基化及去甲基化与肿瘤发生具有密切关系。早期研究发现，20余个甲基化及去甲基化的基因可能与脊索瘤发生相关。Marucci等[28]探讨了颅底脊索瘤中DNA修复蛋白O6-甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶（O-6-methylguanine-DNA methyltransferase, MDMT）的甲基化状态，发现在复发脊索瘤中MDMT基因启动子存在甲基化。Alholle等[29]对复发及未复发的脊索瘤进行全基因组甲基化分析，初步确定了一系列与脊索瘤有关的甲基化位点。了解脊索瘤中基因甲基化水平，有助于深入理解脊索瘤的发生机制，挖掘肿瘤相关的分子标志物。

3.2 非编码RNA

非编码RNA（noncoding RNA, ncRNA）主要包括微小RNA（microRNA）、环状RNA（circular RNA, cirRNA）、长链非编码RNA（long noncoding RNA, lncRNA）等。越来越多的研究表明，非编码RNA参与肿瘤生物学功能的调控。目前，与脊索瘤相关的非编码RNA研究集中在microRNA。microRNA是一类非编码小RNA，通过与目的基因序列特异性结合参与转录后基因表达的调控。miR-1是最早被发现的、在脊索瘤组织、细胞系中下调最为显著的microRNA，其表达增高可抑制脊索瘤细胞生长。随后，Osaka等[30]研究证实， miR-1通过下调slug表达抑制脊索瘤的增殖、转移及侵袭。Zhang等[31]发现miR-608可靶向调控EGFR、Bcl-xL。miR-34a可靶向调控MET，抑制脊索瘤的增殖和侵袭，促进脊索瘤的凋亡。microRNA中，与脊索瘤预后及肿瘤发生相关的还有miR-185-5p、miR-219-5p、miR-1237-3p、miR-155等[27,32-34]。总的来说，虽然脊索瘤相关microRNA研究层出不穷，然而一方面鲜有相同的差异microRNA报道，另一方面针对microRNA调控脊索瘤关键分子的功能研究尚缺乏，差异microRNA作用有待进一步研究证实。除此之外，lncRNA、cirRNA等非编码RNA是目前肿瘤领域的热点话题，而在脊索瘤中尚无相关研究，今后可以通过高通量测序筛选肿瘤及对照组间差异lncRNA及cirRNA，建立其调控上下游分子的交互信号网络，探讨其影响脊索瘤生物学功能的机制。

4 问题与展望

近年来，有关脊索瘤分子调控机制的研究取得了一定进展，为脊索瘤的体内外研究奠定了基础。虽然多个潜在的治疗靶点及关键通路相继被发现，但脊索瘤的有效治疗仍任重道远。探讨lncRNA及cirRNA等非编码RNA在脊索瘤中的作用、寻找影响肿瘤干细胞表型的分子，进一步构建脊索瘤发生发展的调控网络，是改善目前脊索瘤诊治困难的重要途径。总体上，我们对脊索瘤的病因及发病机制了解甚微，且治疗脊索瘤困难重重，深入研究脊索瘤的发病机制，研发新的治疗方法，是未来研究的一个重要方向。