金英消食口服液的HPLC指纹图谱与含量测定研究

任 莹 王 虎 韩 双

安徽省太和县中医院，安徽 太和 236600

金英消食口服液是太和县中医院临床应用多年的特色院内制剂，主要由鸡内金、麸炒白术、焦神曲、焦山楂、焦麦芽、姜半夏、蒲公英、陈皮、茯苓九药味组成。功能健胃醒脾、消食化滞，主要用于脾虚食滞所致的腹胀、纳呆、厌食、腹泻、小儿疳积。金英消食口服液作为质优价廉且临床应用多年的医院传统中药制剂，亟需建立完善的质量控制及评价方法，以保障制剂质量，为其进一步在临床推广应用奠定基础。实验通过高效液相色谱法建立金英消食口服液的指纹图谱和橙皮苷的含量测定方法，并制定橙皮苷的含量限度。

1 仪器与材料

UltiMate3000高效液相色谱仪(DAD检测器，赛默飞世尔科技有限公司)； XP205DR型十万分之一分析天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)；KQ-500DE超声波清洗仪(昆山超声仪器有限公司)，万能粉碎机(上海贺帆仪器有限公司)。

对照品橙皮苷(批号：110721-201617，含量以96.1%计)购自中国食品药品检定研究院；乙腈、甲醇，均为色谱纯，美国天地公司；磷酸，分析纯，天津北方天医化学试剂厂；哇哈哈纯净水

金英消食口服液为太和县中医院中药制剂室生产，批号分别为20160511、20160513、20160515、20180510、20180606、20180720、20180731、20180808、20180818、20180821、20181005、20181007、20190104、20190117、20190306、20190430、20190726、20190810、20190906。缺味阴性样品均由中药制剂室自制。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 对照品溶液的制备 取橙皮苷对照品适量，精密称定，置容量瓶中，加甲醇-0.1%磷酸溶液(1∶1)，制成浓度为每1 mL含10 μg的溶液，即得。

2.1.2 供试品溶液的制备 取金英消食口服液样品，精密量取1 mL，置于10 mL的容量瓶中，加甲醇定容至刻度，混匀，取上清液5 mL置于20 mL的容量瓶中以甲醇-0.1%磷酸(1∶1)溶液定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.1.3 金英消食口服液缺陈皮溶液的制备 按金英消食口服液的制备工艺制得缺陈皮的阴性样品，按“2.1.2”项下的制备方法制备缺陈皮阴性供试液。

2.2 色谱条件 UltiMate3000高效液相色谱仪，依利特Hypersil ODS2色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，以乙腈-0.1%磷酸水溶液(20∶80,V/V)为流动相，流速1.0 mL/min，柱温30 ℃，检测波长283 nm。

2.3 方法学考察

2.3.1 专属性考察 按“2.2”色谱条件，分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液、缺味阴性对照溶液，依次注入高效液相色谱仪，记录色谱图，结果显示，各阴性对照均无干扰(如图1所示)，说明该方法专属性较好。

C图1 对照品(A)、金英消食口服液供试品(B)、缺陈皮对照(C)HPLC图

2.3.2 线性关系考察 将制备的浓度为11.12 μg/mL的对照品溶液，分别精密进样1、2、5、10、15、20 μL，记录色谱图及峰面积。以橙皮苷的量(μg)为纵坐标(Y)，峰面积为横坐标(X)，进行回归分析，得回归方程：Y=0.03021X-5.114×10-4；r=0.9999。结果表明，橙皮苷在为0.01112～0.2224μg的范围内与峰面积呈良好线性关系。见表1、图2。

表1 线性关系考察结果

图2 线性关系考察

2.3.3 精密度试验 取浓度为11.12 μg/mL的对照品溶液，连续进样6次，记录峰面积，橙皮苷的平均峰面积是1.857，RSD为0.1%(n=6)，表明仪器精密度良好。

2.3.4 重复性试验 取金英消食口服液(批号：20160511)6份，按照“2.1.2”项下方法制备供试液，分别进样测定。结果6次的峰面积平均值为1.731，RSD为0.3%，表明该方法的重复性良好。

2.3.5 稳定性试验 取供试品(批号：20160511)溶液，在配制后0、2、5、8、10、12、24h分别进样测定，结果橙皮苷峰面积平均值为1.714，RSD为0.6%(n=6)，表明供试液在24 h内稳定性良好。

2.3.6 加样回收率试验 精密移取已知含量为0.4144 mg/mL的金英消食口服液(批号：20160511)6份，每份0.5 mL，分别精密加入浓度为0.0556 mg/mL的橙皮苷标准品储备液4 mL。按“2.1.2”项下方法制备供试液，分别进样测定，记录峰面积，计算回收率，平均回收率为99.9%(RSD=0.8%,n=6)，可见此方法测定橙皮苷回收率较高，准确度较高。结果见表2。

表2 加样回收试验结果

2.4 含量限度考察 通过投料前对陈皮药材中橙皮苷含量测定，及生产的成品中橙皮苷的含量比较，计算得到该工艺橙皮苷的转移率。结果见表3。

表3 转移率计算结果

结果表明，批号为20160511、20160513、20160515三批金英消食口服液中橙皮苷的含量为0.410～0.411 mg/mL，生产原料陈皮(批号：16030102)中橙皮苷的含量为2.95%～2.98%，制成制剂后相当于每mL含橙皮苷为1.97～1.99mg，最低转移率为20.7%。批号为20161228、20161229、20161230三批金英消食口服液中橙皮苷的含量为0.650～0.686 mg/mL，生产原料陈皮(批号：16090205)中橙皮苷的含量为3.80%～3.81%，制成制剂后相当于每mL含橙皮苷为2.53～2.54 mg，最低转移率为25.6%。根据中国药典2015年版一部规定：陈皮饮片中橙皮苷的含量不得少于2.5%，按最低转移率为20.7%计算，制成制剂后相当于每mL不得少于0.35 mg，故拟定该制剂每mL含橙皮苷不低于0.35 mg。

2.5 指纹图谱的建立[1-4]取16批金英消食口服液样品，分别按照“2.1.2”项下的方法制备供试品溶液，分别进样测定，记录色谱数据，将数据导入“中药色谱指纹图谱相似度评价软件(2012)”，以S1为参照，采用平均数法，时间宽度为0.6，多点校正，自动匹配，生成对照图谱，确定13个共有峰，并计算相似度。16批金英消食口服液叠加图谱及对照图谱见图3。相似度结果均大于0.9，结果见表4。可见不同批次的金英消食口服液样品之间具有较好的相似性，建立的对照图谱特征性较强。

图3 16批金英消食口服液指纹图谱及其对照指纹图谱

表4 相似度分析结果

3 讨论

医疗机构制剂尤其是中药制剂品种是我国新药的来源，如三九胃泰、复方丹参滴丸、大青叶注射液、地龙注射液等都是医疗机构制剂转化成新药的产物。新药的研制在医疗机构制剂基础上，经过长期临床疗效验证，可以有效缩短研发投入和时间，提高研发注册成功率。将特色优秀的医疗制剂转化为新药，可提高我国新药研发质量和水平，促进医药领域健康发展。

金英消食口服液处方系太和县中医院名老中医遵照中医理论，结合多年临床经验，治疗功能性消化不良证属脾虚食滞所拟定的方剂，临床应用多年，疗效显著(尤其是用于小儿疳积)。金英消食口服液中鸡内金[5-6]、焦神曲[7-8]、焦麦[9-10]芽现代研究中尚未有特异的指标性成分；焦山楂[11-12]、姜半夏[13-14]、麸炒白术[15]、蒲公英[16]、茯苓[17]虽然在中国药典及文献中有以氨基酸、有机酸等为对照品的薄层鉴别，但这些成分在动植物中广泛存在，在复方制剂的质控方面专属性不佳，实际运用较少。故利用常规的薄层鉴别方法对该制剂进行定性研究存在较大困难。定量分析方面，上述药味在药典中均无含量控制的指标性成分，只有陈皮规定了含量测定的指标即橙皮苷。

有效控制中药的质量，是保证中医临床疗效的前提。2016年国务院印发《中医药发展战略规划纲要(2016-2030)》，提出“推进实施中药标准化行动计划，构建中药产业全链条的优质产品标准体系”。指纹图谱技术是目前国际上公认的天然药物质量控制的有效方式之一，突破了长期以来以单一指标或几个化学成分评价药品质量的限制，可以全面反映中药所含的化学成分的种类和数量。本实验研究建立金英消食口服液的指纹图谱，并测定橙皮苷的含量，方法特征性强、专属性好、稳定可靠，可用于金英消食口服液的质量控制并纳入质量标准，为金英消食口服液的质量控制提供更全面可靠的依据，进而保证制剂质量，确保临床疗效。实验建立了金英消食口服液的指纹图谱，并确定了13个共有峰，为该制剂进一步的物质基础研究提供参考。