基于网络药理学探讨金荞麦治疗慢性咽炎的作用机制

农达梅 左华江 吴春凤

1.广西医科大学附属柳州市人民医院，广西 柳州 545006；2. 广西科技大学，广西 柳州 545006

咽炎在现代临床医学中作为一种常见的疾病。从相关病理和临床症状上，可以将咽炎划分为慢性类与急性类，其中慢性咽炎是咽黏膜和淋巴组织的慢性炎症疾病[1]，经常也属于人体上呼吸道感染的慢性炎症的一些表现。慢性咽炎一些主要症状表现为咽干、咽疼、咽痒、异物感、烧灼感、微痛、恶心、影响睡眠及影响日常生活等[2]。长期患咽炎的大众，不加以治疗，严重影响人的生活质量。

金荞麦(FagopyrumdibotrysHara)为蓼科荞麦属植物金荞麦的根茎，其根茎为常用中药材，是一种营养丰富并具有重要价值的药资源植。金荞麦别名野荞麦、苦荞头、金锁开银等，在我国的四川、江西、江苏等地都有分布。其性凉，味辛涩，归肺经，具有清热解毒、排脓祛瘀功效，常用于咽喉肿痛、肺热咳嗽、乳蛾肿痛、头风痛、消化不良、肝炎腹胀等病症[3]。现代药理学研究证实，金荞麦有显著的抗癌、抑制肿瘤细胞肺侵袭和转移的作用，此外还具有消炎抗菌、抗衰老、抗氧化酶活性解热抗炎、祛痰镇咳、抗血小板聚集、抗突变、以抵抗自由基的降血糖、血脂作用以及提高免疫力等药理作用[4-6]。赵炎军[7]在研究中认为金荞麦提取物具有一定的体外抗流感病毒作用。本研究利用网络学药理方法，从“药物-化合物-作用靶点-疾病”复杂网状结构探究金荞麦治疗慢性咽炎的关键作用靶点、分子生物学过程、信号通路等。以金荞麦治疗慢性咽炎的基础研究提供参考思路。

1 方法

1.1 获取金荞麦主要化学成分及作用靶点 利用TCMSP(http://tcmspw.com/)数据库找出金荞麦所有的化学成分，以口服利用度(OB)≥30%和类药性(DL)≥0.18作为条件筛选主要有效成分，根据DrugBank数据库获取主要化学成分的预测靶点，并将化合物靶标蛋白逐一输入String、UniProt数据库(https://www.uniprot.org/)检索以剔除重复、非人源的靶点，逐一转化为主要活性化合物规范的靶点蛋白的基因标识符(Gene Symbol)。

1.2 筛选慢性咽炎的相关靶点及潜在作用靶点 Gene Cards数据库克服了上百个数据库自身格式的局限，整理归纳了基因表达、功能、位置、通路、变异、同源基因、疾病和相关参考文献等各种信息，收集整理了上百个网站的内容，并将它们合理地系统地整合到一起。OMIM数据库涵概关于人类遗传病和基因座位等相关信息、和文献的中心级数据库。通过以上两个数据，筛选了有关慢性咽炎的靶点1272个。将上述1.1药物主要化学成分的预测靶点与疾病相关靶点导入Venney2.1分析平台，取交集靶点，获得潜在作用靶点。

1.3 金荞麦化合物-疾病靶点及靶点互作网络图的构建 将筛选过后的主要化学成分与交集的潜在作用靶点输入到Cytoscape3.7.0软件，构建“药物-主要成分-疾病-靶点”网络，进行拓扑学分析。同时将筛选得到的共有靶点导入String平台(http://string-db.org)，将Organism设定为“Homo aspiens”，最小交互分数取0.4，得到靶点互作的(PPI)网络模型。由于STRING数据库无法直观的看出靶蛋白的Degree变化，故将STRING的蛋白互作信息保存为TSV格式并导入Cytoscape3.7.0软件中采用Analyze network工具进行可视化分析，筛选出关键靶点。

1.4 关键靶点GO富集分析及相关信号通路注释分析 为进一步了解上述筛选出的关键靶点的功能及相关信号通路的作用，将上述1.3的得到的关键靶点导入DAVID6.8数据平台进行GO(Gene Ontology)生物学过程富集分析和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes Genomes)信号通路富集分析，设置靶基因名称为人类进行筛选，将所有靶基因名称校正为官方名称(office gene symbol)，通过设定阈值P<0.01，得到生物学过程、分子功能、细分和相关通路分析结果，并利用Origin7.5软件将其结果可视化。

2 结果

2.1 金荞麦主要化学成分的筛选、收集 通过TCMSP平台数据库检索“金荞麦”，总化合物为45种，以OB ≥30%，DL≥0.18为筛选条件选出15个潜在治疗作用的活性化学成分，见表1。15个活性化合物共有100个作用靶点。

表1 金荞麦中主要化学物信息

2.2 共有靶点的收取 将金荞麦潜在活性化合物的作用靶点与Gene Cards数据库及OMIM数据库检索出的慢性咽炎疾病靶点在Venney2.1平台做韦恩图，交集靶点40个，可认这40个靶点是金荞麦治疗慢性咽炎的主要靶点，如图1。

图1 金荞麦活性成分靶点与慢性咽炎靶点Venny图

2.3 PPI网络图构建 将金荞麦治疗慢性咽炎的40个主要靶点导入STRING数据库，得到治疗靶点的PPI网络，通过Cytoscape进行可视化。由图2可知，线条表示靶点与靶点之间相互作用关系。该网络由260条边组成一个完整的蛋白网络互作图。该图中圆形的大小和颜色，从浅色圆形到深色椭圆形，形状越来越大，颜色逐渐加深，表明Degree度值增大。PPI蛋白互作关系具体见表2(仅列出前20个靶点)。由表2可知，靶点平均Degree为13，Average Shortest Path Length(平均最短路径长度)在1.3到2.8之间，网络中节点的Closeness Centrality(连通度)、Betweenness Centrality(介数中心性)曲线接近于幂律分布，其中节点度值越大的节点，平均最短路径长度越短的节点，表明该节点与慢性咽炎的相关性越大，治疗慢性咽炎的可能性最大。超过靶点平均Degree的靶点有14个，可认为这14个靶点为关键靶点。

图2 潜在治疗靶点蛋白互作图

表2 交集靶点及其拓扑学特征(表中仅列出前20个)

2.4 金荞麦化合物-疾病靶点构建分析 从图3可知，金荞麦化合物-疾病靶点网络共有57个节点，127条边，包含了1种药物、1种疾病、15个化合物、40个靶点，其中蓝色棱形为药物，红色椭圆形为疾病，黄色长方形为化合物，绿色三角形为靶点。从度值大小上来看，排名前4位为quercetin(槲皮素)、luteolin(木犀草素)、β-sitosterol (β-谷甾醇)、isorhamnetin(异鼠李素)，节点分别为34、17、8、5，这些化合物成分在治疗慢性咽炎发挥着重要作用。

图3 金荞麦化合物-疾病靶点网络图

2.5 相关通路信息和注释分析 为了进一步阐明金荞麦活性成分的作用机制，将上述2.2预测得到的14关键靶蛋白导入DAVID数据平台(https://david.ncifcrf.gov)GO富集分析，得出148条目，其中包括生物学过程109条，分子功能30条，细胞组分9条，KEGG分析得到47条KEGG信号通路。经Bonferroni校正P<0.01，符合条件的有生物学过程为46条，分别为凋亡过程的负调控(negative regulation of apoptotic process)、药物反应(response to drug)、上皮细胞增殖的阳性调节(positive regulation of epithelial cell proliferation)、细胞对白细胞介素-1的反应(cellular response to interleukin-1)、基因表达阳性调节(positive regulation of gene expression)等，见图4。取P<0.01，符合条件的分子功能有15条，为酶绑定(enzyme binding)、蛋白质异二聚化活动(rotein heterodimerization activity)、转录激活子活性，RNA聚合酶II核心启动子近端区序列特异性结合(transcriptional activator activity, RNA polymerase II core promoter proximal region sequence-specific binding)、转录因子绑定(transcription factor binding)等，见图5。取P<0.01，符合条件的细胞组分有核质(nucleoplasm)、细胞质(cytoplasm)、核(nucleus)、膜(membrane)和膜筏(membrane raft)，见图6。取P<0.01得到31条信号通路，包括蛋白聚糖在癌症(Proteoglycans in cancer)、通路在癌症(Pathways in cancer)、膀胱癌(Bladder cancer)、小分子核糖核酸在癌症(MicroRNAs in cancer)、HIF-1信号通路(HIF-1 signaling pathway)等，见图7。大量的靶蛋白富集在这些注释和信号通路上，通过-log(p)值显现富集相关性大小，p越小，-log(p)值越大，则与疾病相关可能性越大。通过生物学过程、分子功能、细胞组分、相关信号通路来预测慢性咽炎，达到治疗的目的。

注：图中仅根据P值列出前20个生物学过程图4 关键靶蛋白参与生物学过程

图5 关键靶蛋白参与分子功能

图6 关键靶蛋白参与细胞组分

注：图中仅根据P值列出前20个KEGG图7 信号通路柱状图

3 讨论

慢性咽炎(Chronic Pharyngitis)是一种咽喉部黏膜、黏膜下组织及淋巴组织产生的慢性炎症，主要患病人群为青壮年。慢性咽炎治疗起来病程较长，且症状容易反复发作[8]。根据流行病学显示，我国慢性咽炎一直存在着较高的发病率，特别是在空气质量较差的大城市，给众多患者带来烦恼和负担，且较多的医疗资源用于治疗咽炎。而引起咽炎的原因非常多，有慢性感染因素和非感染因素。前者为细菌类感染、菌群紊乱、鼻炎类；后者为职业性暴露、生活习惯及生活环境等[9]。慢性咽炎属于传统医学“喉痹”范畴，在《素问·阴阳别论》[10]中提出咽喉者为阴阳升降之路，喉痹之病机主要是人体出现阴阳失衡。而中药金荞麦具有多成分、多靶点、多通路协同作用的特点，通过多途径发挥直接或间接抗病菌、抗病毒治疗慢性咽炎的作用。现市场上金荞麦片联合莲花清瘟胶囊可起到缓解甲型H1N1流感、咽喉肿痛作用。金荞麦也可作单味药单独使用，具有抗炎、祛痰镇咳的功效，是治疗慢性咽炎的有效药物，但相关报道较少。

本研究通过筛选得到的15种活性成分，主要是黄酮类、甾体、有机酸等化学成分，其中最有意义的是黄酮类，为主要的药理活性成分[11]。具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤和提高机体免疫力等多种药理学功效。从抗炎的角度探究，槲皮素、木犀草素、β-谷甾醇、异鼠李素对慢性咽炎的治疗作用。刘涛等[12]在研究中表明了槲皮素、木犀草素对小鼠镇痛、抗炎、镇咳、祛痰的作用及对家兔的慢性咽炎治疗作用。倪湾[13]阐述槲皮素的抗炎活性可通过NF-kB和Akt信号通路调节炎症因子影响。研究发现，异鼠李素具有抗炎、抗病毒、抗氧化等作用，抗炎主要是通过抑制脂多糖(LPS)诱导的TNF-α，IL-1β和IL-6在体外和体内的分泌[14]。β-谷甾醇大多数存在于植物细胞膜中，其抗炎主要机制是对脂多糖诱导巨噬细胞，提高抗炎因子(IL-10)的活性[15]，β-谷甾醇临床上常用于降低胆固醇。

金荞麦治疗慢性咽炎主要靶点为EGFR、CASP3、ESR1、MYC、IL6等14个。其中EGFR的变化代表慢性咽炎患者的病变水平，在孙恒[16]的研究中表明了血清EGFR的检测在鼻咽癌患者临床诊治中的重要意义。CASP3作为半胱氨酸蛋白酶族的重要成员，可以通过细胞凋亡有序级联反应[17]。MYC的过度表达是人类癌症特征重要的一个特征，认为MYC癌基因通过转录因子，解除大量特定靶蛋白表达的调控，可以通过预测咽炎转化为咽炎癌类型癌症。

经过GO分析和KEGG分析发现，可以发现金荞麦的有效化合物能作用于多个位点。如EGFR、CASP3、IL6、MCL1、RELA、 VEGFA、MDM2、MYC参与凋亡过程的负调控的生物学过程；PGR、EGFR、 CCND1、 HIF1A、ESR1、MDM2参与分子功能中酶绑定；PGR、CASP3、CCND1、HIF1A、MCL1、RELA、ESR1、MDM2、MYC参与细胞组分中核质的相关活动；EGFR、CASP3、CCND1、HIF1A、ERBB2、VEGFA、ESR1、MDM2、MYC靶蛋白涉及在蛋白聚糖在癌症通路上。

综上所述，网络药理学作为一种中药研究的方法，研究了金荞麦治疗慢性咽炎的潜在作用机制，从而阐明了金荞麦治疗慢性咽炎有效成分与作用靶点及信号通路，并明确了金荞麦通过多种活性成分、潜在作用靶点、各种生物学过程及信号通路发挥治疗慢性咽炎的的作用机制，这为金荞麦在慢性咽炎的治疗中提供重要的参考价值。