miR-26a靶向ADAM10对类风湿关节炎滑膜成纤维细胞增殖及迁移的影响

2020-07-24于守杰张振春厉彦山张丽丽

分子诊断与治疗杂志 2020年6期

于守杰张振春厉彦山张丽丽

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种以关节滑膜浸润性增生、关节软骨和骨质破坏为主要病理改变的慢性自身免疫性疾病［1］。成纤维样滑膜细胞（fibroblast-like synoviocyte，FLS）在RA 中起重要作用，FLS 的异常增殖造成的滑膜增生可造成关节畸形，进而加重RA，严重危害患者身体健康［2］。因此，通过抑制FLS 的异常增殖、迁移从而抑制滑膜增生是改善关节炎的重要途径。研究表明miRNA 可通过参与调控FLS 的增殖、迁移影响RA进展［3］。李广科等［4］研究发现RA 患者关节滑液及外周血中miR-26a 异常高表达，其与病情活动程度及炎症程度密切相关，miR-26a 的异常表达可能与病变滑膜组织及浸润细胞的分泌有关。但miR-26a 影响RA 的具体机制尚不清楚。解整合素金属蛋白酶10（a disintegrin and metalloproteinase 10，ADAM10）属于ADAM 家族，是一种跨膜蛋白，研究报道沉默ADAM10 可促进类风湿关节炎滑膜成纤维细胞凋亡，减少炎性因子的分泌［5］。抑制ADAM10 可抑制类风湿关节炎中成纤维样滑膜细胞的迁移和侵袭［6］。因此，本实验旨在研究miR-26a 对RA-FLS 增殖、迁移的影响及机制是否与ADAM10有关。

1 材料与方法

1.1 材料

类风湿性关节炎成纤维滑膜细胞系MH7A 购自美国ATCC；胎牛血清、DMEM 培养基购自武汉益普生物科技有限公司；脂多糖（LPS）购自上海广锐生物科技有限公司；荧光定量试剂盒购自上海恒斐生物科技有限公司；细胞计数试剂盒8（CCK-8）购自杭州仟诺生物科技有限公司；RIPA 蛋白裂解液、二辛可宁酸（bicinchoninic acid，BCA）试剂盒购自上海源叶生物科技有限公司；ADAM10、Ki-67、N-cadherin、E-cadherin、GAPDH 抗体及山羊抗兔IgG-HRP 购自上海恒斐生物科技有限公司；Transwell 小室购自上海研卉生物科技有限公司；双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自北京索莱宝公司。

1.2 细胞处理与分组

MH7A 细胞用含10%胎牛血清的DMEM 培养基在37℃恒温培养箱培养，取对数生长期细胞，用1 μg/mL 的LPS 处理MH7A 记为LPS 组，正常培养的细胞作为对照（Con）组；将miR-NC、miR-26a、pcDNA3.1、pcDNA3.1-ADAM10 分别转染至MH7A中，再用1 μg/mL 的LPS 处理，记为LPS+miR-NC组、LPS+miR-26a 组、LPS+pcDNA3.1 组、LPS+pcDNA3.1-ADAM10 组。将miR-26a 分别与pcDNA3.1、pcDNA3.1-ADAM10 共转染至MH7A 中，再用1 μg/mL 的LPS 处理，记为LPS+miR-26a+pcDNA3.1 组、LPS+miR-26a+pcDNA3.1-ADAM10 组。

1.3 CCK-8 检测细胞增殖活性

将细胞以1×104个/孔接种于96 孔板，培养24 h时每孔中加入10 μL CCK-8 试剂，孵育2 h，酶标仪检测490 nm 波长处的吸光度值（OD）。细胞增殖活性（%）=实验组OD 值/空白对照组OD 值×100%。

1.4 克隆形成实验检测细胞克隆形成数

调整细胞浓度为1×104个/mL，以每孔100 个接种于六孔板中，每组设3 个复孔，培养2 周出现肉眼可见克隆时终止培养，PBS 清洗2 遍，甲醇固定15 min，吉姆萨染色30 min，在低倍光学显微镜下计数＞50 个细胞的集落。

1.5 Transwell 检测细胞迁移

将600 μL 培养液和100 μL 细胞悬液加入Transwell 小室的下室和上室，放入细胞培养箱中培养24 h，4%多聚甲醛固定30 min，PBS 溶液冲洗2 次，室温下加入0.1%结晶紫染色30 min。冲洗2次，用无菌棉球轻轻擦去上室表面细胞，显微镜下随机观察5 个视野，计算细胞迁移数目。

1.6 双荧光素酶报告实验验证miR-26a 和ADAM10 的靶向关系

构建含miR-26a结合位点的ADAM10野生型和突变型载体荧光素酶表达载体，将其分别与miR-NC、miR-26a 共转染至细胞MH7A 中，转染48 h 后，根据双荧光素酶报告基因检测试剂盒说明检测荧光素酶活性。

1.7 统计学分析

采用SPSS 20.0 软件进行数据分析，计量资料用（）表示，两组比较行t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-26a 对类风湿关节炎滑膜成纤维细胞增殖的影响

与对照组相比，LPS 组miR-26a 表达水平显著降低，细胞活性显著升高，克隆形成数显著升高，Ki67 表达水平显著升高（P＜0.05）；与LPS+miR-NC组相比，LPS+miR-26a 组miR-26a 表达水平显著升高，细胞活性显著降低，克隆形成数显著降低，Ki67 表达水平显著降低（图1，表1）。

表1 miR-26a 对类风湿关节炎滑膜成纤维细胞增殖的影响（±s）Table 1 Effects of miR-26a on the proliferation of rheumatoid arthritis synovial fibroblasts（±s）

注：与Con 相比，aP＜0.05；与LPS 相比，bP＜0.05；与LPS+miR-NC 相比，cP＜0.05。

分组Con 组LPS 组LPS+miR-NC 组LPS+miR-26a 组F 值P 值n9999 miR-26a 0.95±0.05 0.25±0.02a 0.26±0.02 0.82±0.04bc 992.816 0.000 OD 值0.43±0.03 1.21±0.08a 1.20±0.08 0.61±0.04bc 380.765 0.000克隆形成数50.04±5.54 122.58±9.73a 123.07±8.07 66.60±6.21bc 225.177 0.000 Ki67 0.20±0.02 0.76±0.05a 0.76±0.04 0.34±0.03bc 555.333 0.000

2.2 miR-26a 对类风湿关节炎滑膜成纤维细胞迁移的影响

与对照组相比，LPS 组迁移细胞数显著升高，N-cadherin 表达水平显著升高，E-cadherin 表达水平显著降低（P＜0.05）；与LPS+miR-NC 组相比，LPS+miR-26a 组迁移细胞数显著降低，N-cadherin表达水平显著降低，E-cadherin 表达水平显著降低（图2，表2）。

2.3 miR-26a 靶向ADAM10

TargetScan 数据库预测显示miR-26a 与AD-AM10 存在结合位点（图3）。荧光素酶报告实验显示，与miR-NC 组相比，miR-26a 组中转染ADAM10 野生型表达载体的细胞荧光素酶活性显著降低（P＜0.05）；而转染ADAM10 突变型表达载体的细胞荧光素酶活性比较，差异无统计学意义（P＞0.05）（表3）。与miR-NC 组相比，miR-26a 组ADAM10 表达水平显著降低（P＜0.05）（表4）。

表2 miR-26a 对类风湿关节炎滑膜成纤维细胞迁移的影响（±s）Table 2 Effect of miR-26a on the migration of rheumatoid arthritis synovial fibroblasts（±s）

注：与Con 相比，aP＜0.05；与LPS 相比，bP＜0.05；与LPS+miR-NC 相比，cP＜0.05。

分组Con 组LPS 组LPS+miR-NC 组LPS+miR-26a 组F 值P 值n9999迁移细胞数51.64±4.86 129.27±6.73a 129.03±6.77 68.22±5.50bc 407.921 0.000 N-cadherin 0.29±0.03 0.84±0.06a 0.85±0.06 0.37±0.03bc 357.967 0.000 E-cadherin 0.71±0.04 0.17±0.01a 0.18±0.01 0.54±0.03bc 964.444 0.000

表3 双荧光素酶实验（±s）Table 3 Double luciferase experiments（±s）

分组miR-NC 组miR-26a 组t 值P 值n99 WT-ADAM10 1.00±0.06 0.16±0.01 41.429 0.000 MUT-ADAM10 0.99±0.05 0.96±0.06 1.152 0.266

表4 miR-26a 调控ADAM10 的表达（±s）Table 4 miR-26a regulates ADAM10 expression（±s）

分组miR-NC miR-26a t 值P 值n99 ADAM10 0.58±0.03 0.21±0.01 35.101 0.000

2.4 ADAM10 对类风湿关节炎滑膜成纤维细胞增殖、迁移的影响

与LPS+pcDNA3.1 组相比，LPS+pcDNA3.1-ADAM10 组ADAM10 表达水平显著升高，细胞活性显著升高，克隆形成数及迁移细胞数显著升高，Ki67、N-cadherin 表达水平显著升高，E-cadherin 表达水平显著降低（P＜0.05）（图4，表5）。

2.5 ADAM10 能逆转miR-26a 对类风湿关节炎滑膜成纤维细胞增殖、迁移的影响

与LPS+miR-26a+pcDNA3.1 组相比，LPS+miR-26a+pcDNA3.1-ADAM10 组细胞活性显著升高，克隆形成数及迁移细胞数显著升高，Ki67、N-cadherin 表达水平显著升高，E-cadherin 表达水平显著降低（P＜0.05）。见表6、图5。

表5 ADAM10 对类风湿关节炎滑膜成纤维细胞增殖、迁移的影响（±s）Table 5 Effects of ADAM10 on the proliferation and migration of rheumatoid arthritis synovial fibroblasts（±s）

分组LPS+miR 26a+pcDNA3.1 LPS+miR 26a+pcDNA3.1 ADAM10 t 值P 值n 9 9 OD 值0.61±0.04 1.05±0.11 11.278 0.000克隆形成数66.58±5.79 108.24±7.35 13.357 0.000迁移细胞数68.23±5.55 114.15±7.32 14.997 0.000 Ki67 0.33±0.03 0.57±0.04 14.400 0.000 N cadherin 0.37±0.04 0.68±0.05 14.524 0.000 E cadherin 0.54±0.03 0.27±0.02 22.465 0.000

表6 ADAM10 能逆转miR-26a 对类风湿关节炎滑膜成纤维细胞增殖、迁移的影响（±s）Table 6 ADAM10 can reverse the effect of miR-26a on the proliferation and migration of rheumatoid arthritis synovial fibroblasts（±s）

分组LPS+pcDNA3.1 组LPS+pcDNA3.1-ADAM10 组t 值P 值n 9 9 ADAM10 0.54±0.04 1.18±0.12a 15.179 0.000 OD 值1.22±0.07 1.55±0.13a 6.705 0.000克隆形成数122.60±9.71 161.73±10.04a 8.405 0.000迁移细胞数129.28±6.81 172.72±7.03a 13.315 0.000 Ki67 0.76±0.05 1.15±0.11a 9.683 0.000 N-cadherin 0.83±0.06 1.24±0.12a 9.168 0.000 E-cadherin 0.18±0.01 0.06±0.01a 25.456 0.000

3 讨论

RA 是自身免疫性疾病，其主要的病理特点是滑膜增生并侵蚀关节软骨和骨质，最终导致关节破坏畸形；FLS 在RA 的发生发展中起重要作用，寻找与FLS 相关的RA 治疗靶点，通过阻断滑膜增生和骨质侵蚀来阻断或延缓RA 的进展对治疗RA 具有重要的理论与现实意义［7］。且miR-26a 可改善大鼠的关节炎［8］。为研究miR-26a 是否影响FLS进而影响RA，本实验用LPS 处理MH7A 细胞模拟RA 体内环境，结果显示LPS 可诱导FLS 增殖和迁移，表明类风湿关节炎滑膜成纤维细胞模型建立成功。且本实验结果显示miR-26a 表达水平显著降低，与前人研究结果相符。本实验结果提示miR-26a 可能是与FLS 相关的RA 靶点。

已有研究报道RA 血清中ADAM10 高表达，ADAM10 可介导类风湿关节炎中的单核细胞迁移和粘附［9］。ADAM10 是托珠单抗治疗RA 疗效的预测指标［10］。表明ADAM10 不仅影响RA 发生发展，还可作为其预测指标。而本实验结果显示，过表达ADAM10 可促进类风湿关节炎滑膜成纤维细胞增殖、迁移。表明ADAM10 可参与调控RA-FLS 的增殖、迁移。此外，还有研究报道miR-152 可通过靶向ADAM10 抑制RA-FLS 增殖并诱导凋亡［11］。为研究miR-26a 影响RA-FLS 增殖、迁移的机制是否与ADAM10 有关，本实验通过TargetScan 数据库预测miR-26a 可能的靶mRNA，结果显示miR-26a 与ADAM10 的3′UTR 存在结合位点，双荧光素酶报告实验表明miR-26a 靶向负调控ADAM10 表达。本实验同时过表达ADAM10 和miR-26a 后，结果显示过表达ADAM10 逆转了miR-26a 对RA-FLS 增殖、迁移的抑制作用。提示，miR-26a 可能通过调控ADAM10 影响RA-FLS 增殖、迁移。

综上所述，过表达miR-26a 可能通过靶向下调ADAM10 抑制类风湿关节炎滑膜成纤维细胞的增殖、迁移。为通过靶向抑制FLS 的异常增殖、迁移从而抑制滑膜增生是改善类风湿关节炎提供了新靶点和理论依据。