复发性流产孕妇血清25（OH）D水平与炎症因子、自身免疫抗体及T淋巴细胞亚群分布的相关性分析

郝月兰 刘辉 吕明云 滕怀香

复发性流产（Recurrent spontaneous abortion，RSA）是指连续发生2 次或2 次以上的自然流产，目前认为其病因主要包括染色体异常、母体生殖道异常、母体内分泌异常等［1-2］，但部分RSA 孕妇上述各项检查均正常、具体病因不明，探索不明病因RSA 孕妇的发病机制是当下妇产科研究的重点。近年研究［3-4］发现维生素D 在胚胎种植的免疫调节中发挥重要作用，且足量的维生素D 可提高体外受精成功率。关于维生素D 在RSA 发生中扮演的角色尚未有明确定论，25-羟维生素D［25（OH）D］是维生素D 的活性成分，文中探讨RSA孕妇血清中25（OH）D 的表达情况，进一步探讨25（OH）D 与机体免疫炎症的内在联系，旨在明确不明病因RSA 孕妇的可能致病因素并为后续临床干预提供新思路。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2018年1月至2019年12月间在本院进行清宫的复发性流产孕妇40 例作为RSA 组，年龄22～35（28.94±5.23）周岁，体质指数（23.71±3.04）kg/m2，月经周期（28.49±4.51）d；选取同期在本院进行人工流产的健康女性40 例作为对照组，年龄21～38（28.67±5.51）周岁，体质指数（23.59±3.21）kg/m2，月经周期（28.52±4.88）d。均为无疾病状况下本人要求进行流产术、本人签署知情同意书。两组孕妇在年龄、体质指数、月经周期的分布，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。研究计划得到本院伦理委员会批准。

纳入标准：①符合中华医学会妇产科学分会产科学组制定的《复发性流产诊治的专家共识》［5］中对RSA 的定义；②既往无RSA 针对性治疗史；③患者年龄20～50 周岁；④夫妻双方染色体核型均正常；⑤月经周期规律，入组前3 个月内无维生素D 服用史；⑥本人签署知情同意书。排除标准：①合并盆腔生殖道器质性疾病；②宫颈分泌物检测出生殖道感染；③合并血液高凝状态；④男方精液异常。

1.2 方法

1.2.1 血清25-羟维生素D、炎症因子水平检测

清宫术实施前24 h，留取两组孕妇的空腹外周静脉血标本约5.0 mL，室温静置24 h 后留取上层血清。应用USA BIO-RAD 680 型全自动酶标仪、酶联免疫吸附法试剂盒（上海西唐公司）检测血清中25（OH）D 的水平，按照20 ng/mL 作为阈值将复发性流产组孕妇分为高25（OH）D 组（16 例）、低25（OH）D 组（24 例）。采用酶联免疫吸附法（上海西唐公司）检测复发性流产孕妇血清中炎症因子白介素-6（IL-6）。

1.2.2 自身免疫抗体水平检测

RAS 孕妇的空腹外周静脉血标本同1.2，采用间接免疫荧光法试剂盒（北京生东科技公司）检测其中抗心磷脂抗体（ACA）、抗子宫内膜抗体（AEMAb）、抗HCG 抗体（AHCGAb）、抗核抗体（ANA）的阳性表达情况，采用化学发光免疫分析法（贝克曼库尔特公司）检测甲状腺过氧化物酶抗体（TPOAb）的阳性表达情况。

1.2.3 T 淋巴细胞亚群分布情况检测

RAS 的空腹外周静脉血标本同1.2，采用USA BD FACSCanto II 流式细胞仪及相应试剂（BD 公司）检测CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD19+、CD56+T 淋巴细胞的分布情况。

1.3 统计学方法

使用软件SPSS 20.0 对数据进行处理，两组间计数资料以n（%）表示、比较采用χ2检验；计量资料以（）表示，独立样本比较采用t检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组血清25（OH）D 水平比较

RSA 组孕妇血清中25（OH）D 的水平为（18.39±2.76）ng/mL，正常组孕妇血清中25（OH）D的水平为（34.72±5.19）ng/mL。RSA 组孕妇血清中25（OH）D 的水平显著低于对照组孕妇，差异有统计学意义（t=25.406，P=0.000）。

2.2 不同25（OH）D 水平RSA 患者炎症因子、T 淋巴细胞亚群比较

低25（OH）D 组孕妇血清中IL-6 水平低于高25（OH）D 组，差异有统计学意义（P＜0.05）。低25（OH）D 组孕妇外周血中CD3+、CD3+CD4+T 淋巴细胞的分布比例高于高25（OH）D 组孕妇，差异有统计学意义（P＜0.05）。两组间CD3+CD8+T 淋巴细胞分布比例的差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 不同25（OH）D 水平RSA 患者炎症因子、T 淋巴细胞亚群比较（±s）Table 1 Comparison of inflammatory cytokines and T lymphocyte subsets between RSA patients with different 25（OH）d levels（±s）

表1 不同25（OH）D 水平RSA 患者炎症因子、T 淋巴细胞亚群比较（±s）Table 1 Comparison of inflammatory cytokines and T lymphocyte subsets between RSA patients with different 25（OH）d levels（±s）

组别低25（OH）D 组高25（OH）D 组t 值P 值n 24 16 IL-6（pg/mL）11.30±1.67 15.62±2.39 9.371 0.000 CD3+（%）73.48±3.29 68.36±3.40 6.844 0.000 CD3+CD4+（%）45.83±5.19 36.20±4.56 8.816 0.000 CD3+CD8+（%）25.81±4.52 25.76±4.19 0.051 0.480

2.3 不同25（OH）D 水平RSA 患者自身免疫抗体比较

低25（OH）D 组孕妇外周血中ACA、AEMAb、AHCGAb、ANA、TPOAb 的阳性率高于高25（OH）D 组孕妇，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 不同25（OH）D 水平RSA 患者外周血自身免疫抗体阳性率的比较［n（%）］Table 2 Comparison of autoantibody positive rates in peripheral blood between RSA patients with different 25（OH）d levels［n（%）］

2.4 相关性分析

Pearson 检验发现，RSA 孕妇血清中25（OH）D的水平与IL-6 的水平呈正相关（P＜0.05）；与ACA、AEMAb、AHCGAb、ANA、TPOAbCD3+、CD3+CD4+T 淋巴细胞的分布比例的水平呈负相关差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

3 讨论

维生素D 缺乏是一个世界性问题，且在妊娠期女性中也普遍存在。维生素D 的基础功能是调节钙磷代谢，最新研究认为其也参与免疫、生殖等生理过程［6-7］。Li N［8］的研究发现，RSA 妇女的母-胎界面维生素D 及其受体表达减少，推测维生素D 缺乏是导致RSA 发生的重要因素之一。本研究发现RSA 组孕妇血清中25（OH）D 的水平较正常流产孕妇有显著降低，说明异常低水平的25（OH）D 与RSA 的发生有关，低水平的25（OH）D 可能通过影响炎症反应及免疫应答来参与RSA 的发病。基于此，本研究将进一步从炎症反应、自身免疫抗体、T 淋巴细胞亚群三方面展开阐述。

母胎界面中免疫耐受的建立是保证胎儿生长发育的基础，分布在母胎界面的Th1/Th2 细胞对母胎免疫耐受的建立至关重要。Th1 细胞分泌的细胞因子IL-2、TNF-α 等可调控细胞增殖分化并能量代谢、为胎儿生长发育提供良好的环境，但过高的Th1 细胞因子水平会引起免疫排斥、增加胎盘植入难度［9］。Th2 细胞分泌IL-6 等细胞因子，可刺激B 细胞活性并降低排斥作用，增加母胎之间的适应性及相容性［10］。本研究发现，低25（OH）D 组孕妇血清中IL-6 的水平较低且RSA 孕妇血清25（OH）D 水平与IL-6 的水平呈正相关，结合IL-6 在免疫耐受维持中的作用分析，25（OH）D 表达减少可能抑制Th2 细胞因子IL-6 的释放，进而影响妊娠的维持。

表3 RSA 孕妇25（OH）D 与炎症因子、自身免疫抗体及T 淋巴细胞亚群分布的相关性Table 3 Correlation between 25（OH）D and inflammation cytokine，autoimmune antibodies and T lymphocyte subsets distribution in RSA pregnant women

RSA 孕妇母胎界面免疫应答的异常多伴有自身免疫功能异常。朱晓芳［11］、严兆华［12］的研究均证实RSA 的出现与自身抗体的异常高表达相关。ACA、ANA、TPOAb 属于组织特异性抗体，可能通过激活全身免疫系统引起母胎界面免疫调节异常；AEMAb、AHCGAb 属于生殖免疫抗体，有研究［13］发现孕12 周以前的早期流产孕妇上述自身免疫抗体的阳性率显著高于晚期流产者。此外，T 细胞亚群异常是RSA 患者自身免疫应答异常的另一特征，Ren J［14］的证实人类蜕膜组织中存在大量淋巴细胞，当CD4+T 淋巴细胞被异常激活时可能对滋养细胞产生潜在毒性。

综上所述，可得出结论：RSA 孕妇存在25（OH）D 异常低水平，且与机体免疫炎症反应紊乱程度密切相关，低水平的25（OH）D 可能由此参与RSA 的发生发展。关于25（OH）D 表达改变对胚胎细胞各种生物学行为的直接影响，有待后续基础研究进一步明确。