基于高效高压差低温连续式提取技术的五指毛桃提取工艺研究

刘常青，黄伟明，王旭龙，宋力飞，马志鹏

(广州泽力医药科技有限公司，广东 广州 510663)

五指毛桃，别名五指牛奶、土黄芪，为桑科植物粗叶榕(FicushirtaVahl.)干燥后的根，是华南地区煲汤保健常用药食两用中药材，具有健脾利湿、益肺止咳、舒筋通络的功效，常用于脾虚浮肿、食少无力、肝炎、风湿痹痛、肺痨咳嗽等症的治疗[1-3]。现代研究表明，五指毛桃含有丰富的多糖、生物碱、香豆素、黄酮等活性物质，其中五指毛桃的主要有效成分为香豆素类化合物——补骨脂素，具有消炎、抗病毒、抑制肿瘤、抗凝、免疫调节和影响药物代谢等作用[4-7]。目前文献报道的五指毛桃中补骨脂素的提取溶剂多为有机溶剂，方法各不相同，如甲醇冷浸提取法、三氯甲烷水浴回流提取法、乙醇超声提取法、甲醇超声提取法等[8-12]。有机溶剂易残留，造成安全隐患。本研究首次运用高效高压差低温连续式提取分离浓缩技术及成套装备对五指毛桃进行提取，并以五指毛桃中主要有效成分补骨脂素的提取率为指标，对工艺参数进行优化，对五指毛桃提取物的规模化提取提供一定的技术支持与理论指导。

1 材料与仪器

1.1 材料与试剂

五指毛桃(玉林市弘健中药材有限公司)；补骨脂素对照品(批号：190113，纯度：≥99%)；甲醇(分析纯)；乙腈(色谱纯)。

1.2 仪器与设备

高效高压差低温连续式提取分离浓缩技术及成套装备(广州泽力医药科技有限公司)；Agilent 1100高效液相色谱仪(Agilent公司)；KQ-300VDE型双频数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

2 方法与结果

2.1 工艺流程

五指毛桃提取工艺流程：粉碎→高压差提取→离心(取清液)→微滤(取清液)→反渗透(取浓液)→真空浓缩→五指毛桃提取物。

2.2 补骨脂素含量的测定

2.2.1 供试品制备 将五指毛桃粉碎，精密称取五指毛桃细碎品1 g，加入10 mL甲醇，超声(功率100 W，频率40 kHz)提取30 min(水温升高约1 ℃)，冷却至室温后用甲醇补足失质量，摇匀，滤过，滤过液用0.45 μm微孔滤膜(有机)过滤，取续滤液作为供试品溶液，备用。

2.2.2 色谱条件 色谱柱：DIKMA Platisil ODS柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相：55%乙腈(B)-水，运行时间：15 min，检测波长：246 nm，柱温：30 ℃，流速：1.0 mL/min，进样体积：20 μL。

2.2.3 标准曲线的绘制 精密称取补骨脂素对照品10 mg，加甲醇溶解定容至10 mL。分别精密吸取对照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL，用甲醇稀释配制成0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL的标准溶液，在“2.2.2”项色谱条件下进样，以浓度(X)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标，绘制标准曲线并进行线性回归，得回归方程为：Y=136221X+752.5，R2=0.999 4。结果表明，补骨脂素在0.1～0.5 mg/mL浓度范围内与其峰面积积分线性关系良好。

2.2.4 精密度试验 精密吸取0.03 mg/mL对照品溶液及供试品溶液，分别按照“2.2.2”项下色谱条件连续进样6次，记录峰面积，结果对照品溶液峰面积的RSD为0.68%，供试品溶液RSD为1.97%。

2.2.5 重复性试验 取同一批次五指毛桃药材6份，每份1 g，按照“2.2.1”项下方法对供试品溶液进行制备，分别进样测定补骨脂素的峰面积，结果RSD为1.83%。

2.2.6 稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液，分别于0、1、2、4、8、12、24、48 h进样测定，进样量20 μL，分别记录补骨脂素的峰面积，平均峰面积为30 587.52，RSD为1.32%，供试品溶液在48 h内稳定。

2.2.7 加样回收试验 精密称取已知补骨脂素含量为0.22 mg/g的供试品6份，每份约0.5 g，依次加入浓度为0.01 mg/mL的对照品溶液10 mL，按照“2.2.1”项下方法制备供试品溶液，分别进样测定，记录峰面积。补骨脂素平均回收率为101.27%，RSD为1.41%。

2.3 提取率的计算

2.4 单因素试验

以水为溶剂，通过高效高压差低温连续式提取技术对五指毛桃进行提取，以五指毛桃功效成分补骨脂素的提取率为评价指标，选择提取次数、提取料液比、提取压力三个因素进行单因素试验，考查其对五指毛桃中补骨脂素提取率的影响。

2.4.1 提取次数对提取率的影响 固定提取料液比为1∶15，提取压力为30 MPa，考察提取次数为1、2、3、4、5次条件下对补骨脂素提取率的影响，结果见图1。

图1 提取次数对提取率的影响

由图1可知，提取次数在2～5次时提取率逐渐提高，在提取2次时出现明显拐点，但在提取3次后提取率变化不明显，综合能耗、提取效率、浓缩效率等方面考量，将提取次数确定为2次。

2.4.2 提取料液比对提取率的影响 固定提取次数为2次，提取压力为30 MPa，分别在提取料液比为1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30条件下进行试验，考察提取料液比对五指毛桃中补骨脂素提取率的影响，结果见图2。

图2 提取料液比对提取率的影响

随着提取料液比的增大，提取率呈不断增大趋势，当料液比为1∶20时，五指毛桃中补骨脂素提取率出现明显拐点，当料液比进一步增大时，提取率趋势变得平缓。因此，确定料液比为1∶20。

2.4.3 提取压力对提取率的影响 固定提取次数为2次，提取料液比为1∶20，分别在提取压力为20 MPa、25 MPa、30 MPa、35 MPa、40 MPa条件下进行试验，考查提取压力对五指毛桃中补骨脂素提取率的影响，结果见图3。

图3 提取压力对提取率的影响

从图3可以看出，随着提取压力的不断增大，五指毛桃中补骨脂素的提取率呈增加趋势，当提取压力为30 MPa时，随着提取压力的增加，提取率增加效果不明显，30 MPa提高至40 MPa时，提取率变化幅度约为1%，由于较高的提取压力对提取设备的磨损较大，综合实际因素考量，确定提取压力为30 MPa。

2.5 正交试验设计

在单因素试验结果的基础上，以五指毛桃中补骨脂素的提取率为评价指标，选取提取次数、料液比、提取压力三个因素进行正交试验，对提取工艺条件进行优化，因素水平设计见表1。

表1 正交试验因素与水平

2.6 五指毛桃提取工艺优化

五指毛桃提取工艺优化正交试验结果及方差分析见表2、表3。影响五指毛桃补骨脂素提取率的因素主次顺序为A(提取次数)>C(提取压力)>B(料液比)，最佳工艺条件为A3B2C3，即：提取次数为3次，料液比为1∶20，提取压力为35Mpa。此试验条件在正交表中并未出现，通过补充试验验证，得到补骨脂素的提取率为82.27%，大于正交试验结果中出现的最高值，说明利用正交试验对五指毛桃提取工艺进行优化是有效的。

表2 正交试验设计与结果

表3 方差分析

2.7 验证试验

在最优工艺条件下，即提取次数为3次，提取料液比为1∶20，提取压力为35Mpa，进行3次验证试验，得到补骨脂素的平均提取率为81.38%，说明基于高效高压差低温连续式提取技术的五指毛桃提取工艺优化结果可靠性良好。

3 讨论

本研究以水为溶剂，基于高效高压差低温连续式提取技术对五指毛桃提取工艺进行了优化，结果表明，在提取次数为3次，料液比为1∶20，提取压力为35 Mpa的条件下，提取率达82.27%。五指毛桃为华南地区煲汤保健常见药食两用中药材，具有健脾利湿、益肺止咳、舒筋通络的功效。以水为溶剂对五指毛桃进行提取，提取物不存在有机溶剂残留的隐患，在功能性食品中添加具有很大优势，为五指毛桃产品的开发提供了参考，为基于高效高压差低温连续式提取技术的五指毛桃提取规模化生产提供了理论指导。