延边黄牛FABP4基因组织表达及基因多态性分析

尹宝珍，邵 静，焦 石，殷成港，夏广军

(延边大学 农学院，吉林 延吉 133000)

延边黄牛是我国著名的五大地方良种牛之一，生产实践证明其具有生产高档牛肉的遗传基础，而随着分子遗传学研究的不断深入，从分子角度改良肉质已成为一种趋势。脂肪酸结合蛋白4(fatty acid binding protein 4，FABP4)是脂肪细胞和巨噬细胞分泌的一种脂肪因子，能转运脂类，促进细胞的分化，调控脂类代谢和脂肪沉积。UYSAL等[1]研究表明，敲除小鼠FABP4基因，降低了血浆胆固醇和甘油三酯水平，血脂异常也有所改善。HOASHI等[2]研究发现，日本黑毛和牛FABP4基因的多态性与肌内棕榈油酸含量显著相关。闫伟等[3]研究表明，藏绵羊FABP4基因多态性与肌内脂肪(intramuscular fat，IMF)含量有关。SUNG等[4]研究表明，韩牛FABP4基因g.3691G>A位点与背膘厚和大理石花纹性状显著相关，可以作为韩牛肉质性状的候选基因。夏广军[5]研究发现FABP4基因在延边黄牛公牛和阉牛的背最长肌中差异表达，推测可能是影响延边黄牛肉质性状的候选基因。FABP4基因在畜禽脂肪沉积中发挥重要作用，但在延边黄牛群体中的作用机制尚不明确。本试验通过实时荧光定量PCR检测延边黄牛不同组织中FABP4基因的表达水平，分析肌肉组织FABP4基因的表达量与肌内脂肪沉积的关系；利用直接测序和PCR-RFLP技术分析FABP4基因多态位点与延边黄牛肉质性状的关联性，为研究延边黄牛肌内脂肪沉积机理和肉质选育筛选奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验动物从饲养管理、饲料配方和养殖环境一致的延边黄牛育肥牛中随机选择30月龄公牛120头(由珲春吉兴牧业有限公司提供)。屠宰前每头牛颈静脉采血25 mL，加入抗凝剂，分装-80℃保存备用；另采集第12,13肋骨间背最长肌和后腿肌，保存于-20℃，用于测定肌内脂肪和肉质性状。屠宰后随机选取3头公牛采集肾脏、肺脏、心脏、脾脏、肝脏、后腿肌及背最长肌各3 g，用眼科剪剪成0.3 cm3的组织块装入冻存管，投入液氮保存，用于提取总RNA。

1.2 基因组DNA、RNA提取及cDNA的合成参照TIANGEN-血液基因组DNA提取试剂盒说明书提取延边黄牛DNA样本，并用1%琼脂糖凝胶检测。

根据Invitrogen Trizol试剂说明书提供的方法和步骤，提取延边黄牛上述组织的总RNA。

在冰上配制混合液：dNTP 混合液(10 mmol/L)1 μL，寡 dT 引物(2.5 μmol/L)1 μL，RNA 2 μL，Nuclease-free H2O 6 μL，Total Volume 10 μL。在 PCR 仪上65℃反应5 min；4℃放置。建立反转录反应液：上述反应液 10 μL，5× 反转录缓冲液 4 μL，RNase抑制剂(40 U/μL) 0.5 μL，Reverse transcriptase 0.5 μL，Nuclease-free H2O 5 μL，Total Volume 20 μL。反转录程序：42℃ 30 min；95℃ 5 min；4℃保存。cDNA于-20℃保存备用。

1.3 实时荧光定量PCR以GAPDH作为内参基因，应用实时荧光定量PCR仪检测FABP4基因在不同组织中的表达。根据FABP4、GAPDH基因序列，利用primer5.0和Oligo6.0引物设计软件设计实时荧光定量引物。引物序列见表1。

表1 实时荧光定量引物序列

反应体系：2×miRcute Plus miRNA Premix(with SYBR&ROX)10 μL，上下游引物(10 μmol/L)各 1 μL，cDNA 5 μL，Nuclease-free H2O补齐至20 μL。反应程序：95℃反应45 min；94℃反应20 s；64℃ 反应30 s，40个循环。

1.4 FABP4基因多态性检测

1.4.1引物设计与合成 使用Primer Premier 5.0设计FABP4( NC-007312.4 )引物，引物序列见表2。引物由生工生物技术有限公司(上海)合成。

表2 PCR检测引物序列

1.4.2PCR扩增及测序 PCR扩增总体积为20 μL，含2 μL的DNA模板、上下游引物各0.5 μL、7 μL的ddH2O、10 μL的2×Taq PCR Mastermix。程序如下：预变性95℃ 5 min；变性94℃ 30 s，55℃退火30 s，72℃ 延伸30 s，30个循环；72℃ 延伸10 min；4℃保存。用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，放至凝胶成像系统观察其扩增结果。将所有PCR扩增产物及相应引物分装送至生工生物技术有限公司(上海)进行测序。

1.4.3PCR-RFLP酶切反应 将测序结果通过Chromas与原序列进行比对，寻找PCR扩增片段上存在的突变位点，并利用最适限制性内切酶NlaⅢ酶对PCR扩增产物进行酶切分型。反应体系为：1.4.2扩增产物10 μL，0.5 μL，10×CutSmart Buffer 0.5 μL ，37℃酶切2 h，65℃ 20 min终止反应，1%琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物，放至凝胶成像系统观察酶切结果。

1.5 数据分析采用2-△△CT方法计算FABP4基因的相对表达量，其中△Ct目的基因=Ct目的基因-Ct内参基因，△△Ct = △Ct试验组-△Ct对照组。

采用SPSS Statistics统计软件对基因多态性与肉质性状关联分析的试验数据进行单因素方差分析(one way-ANOVA)，结果为平均值±标准差，P<0.05为结果差异显著。

2 结果

2.1 FABP4基因组织表达特征分析由图1可以看出，以肾脏为参照，FABP4基因在延边黄牛7个组织中都有表达，表达水平从高到低依次为心脏、背最长肌、后腿肌、脾脏、肝脏、肺脏、肾脏。其中，在心脏中的表达量极显著高于脾脏、后腿肌、肺脏、肝脏、肾脏(P<0.01)。

图1 FABP4基因的组织表达谱 A.差异极显著(P<0.01)

2.2 FABP4基因在肌肉组织中的表达水平与IMF含量的相关性分析由表3可以看出，背最长肌组织FABP4 mRNA表达量与IMF含量呈极显著正相关(P<0.01)，相关系数为0.994。后腿肌组织FABP4 mRNA表达量与IMF含量呈显著正相关(P<0.05)，相关系数为0.952。

表3 FABP4 基因mRNA表达水平与IMF含量的相关分析

2.3 延边黄牛FABP4基因多态位点检测对延边黄牛FABP4基因进行扩增，结果如图2所示，在约565 bp处存在单一、明亮的条带，与目的条带大小一致；经测序分析，在第三外显子发现g.3691 G>A位点，如图3所示；该位点293 bp处有NlaⅢ酶酶切位点，对该位点进行酶切，如图4，显示出3种基因型，即GG基因型(469 bp)；GA基因型(469,236,233 bp)和AA基因型(236,233 bp)。

图2 FABP4基因位点的扩增

图3 FABP4基因引物g.3691 G>A位点测序结果

图4 FABP4基因g.3691 G>A位点NlaⅢ酶酶切电泳图

2.4 FABP4基因多态性与肉质性状关联分析通过对FABP4基因多态性与延边黄牛肉质性状进行关联分析，结果见表4，可知，g.3691 G>A位点GG基因型的水分含量显著高于GA和AA基因型(P<0.05)，GA基因型的脂肪含量显著高于GG和AA基因型(P<0.05)，GG和AA基因型的蛋白含量显著高于GA基因型(P<0.05)。

表4 FABP4基因多态性与肉质性状的关联分析

3 讨 论

FABP4基因最早被 SPIEGELMAN等[6]在脂肪细胞中发现，参与细胞内脂肪酸的转运和代谢，是研究畜禽脂肪沉积与代谢的热门候选基因。谈笑[7]利用3T3-L1细胞超表达FABP4基因，显著促进脂肪细胞的分化与脂质沉积；干扰FABP4基因表达，抑制脂肪细胞的分化。魏胜娟[8]研究表明，FABP4正向调控牛脂质代谢，在脂肪细胞脂质代谢调控网络中起着重要作用。屠云洁等[9]研究发现，清远麻鸡的FABP4基因主要在腹脂、肝脏中表达，在心肌、胸肌和腿肌中均不表达。FABP4基因在鸭的大部分组织中均有表达，其中在脂肪组织中表达量最高，在肾、肺、间脑中不表达[10]。鹅FABP4基因在脂肪、肾、心中表达量较高，在肌肉、肺、胃、肝、垂体、下丘脑、睾丸中存在微量表达，在脾、小肠不表达[11]。LIU等[12]用RT-PCR检测发现FABP4 基因在大鼠各组织中广泛表达。李晓玲[13]利用半定量RT-PCR方法检测了猪各组织中FABP4基因的表达，结果发现在背最长肌、心、脾、肝、肺、腿肌、肾中均有表达，而腿肌、背最长肌的表达量最高，肺的表达量最低。本研究利用qRT-PCR检测了FABP4基因在延边黄牛不同组织中的表达量，结果表明FABP4基因在背最长肌、心脏、后腿肌、肝脏、肾脏、脾脏、肺脏都有表达，在心脏中的表达量最高，在肾脏中的表达量最低。心脏中的表达量极显著高于脾脏、后腿肌、肺脏、肝脏、肾脏，可能是物种的差异和实验条件的不同导致本研究结果与上述报道不一致。

徐秋良等[14]研究表明，FABP4基因在90，120，160和200日龄绵羊背最长肌中的表达量与相应日龄的背最长肌肌内脂肪含量呈正相关。GERBENS等[15]研究显示，猪FABP4基因mRNA表达量与IMF含量显著相关。余俊旭[16]研究发现，天府肉羊股二头肌中FABP4基因的表达量与股二头肌中IMF含量表现为显著负相关。本研究结果表明，延边黄牛后腿肌与背最长肌中FABP4基因表达差异显著，FABP4基因在后腿肌中的表达量与IMF含量显著正相关，FABP4基因在背最长肌中的表达量与IMF含量极显著正相关。提示FABP4基因的表达影响肌内脂肪含量，并在不同部位肌肉组织中存在表达差异。

KENJI等[17]检测日本黑牛FABP4 基因多态性时发现，FABP4 基因I74V位点影响脂肪酸的形成。余横伟等[18]研究发现，FABP4基因g.2834 C>G位点CC基因型眼肌面积及脂肪含量显著高于CG和GG基因型；g.4420 A>G位点TT基因型背膘厚显著高于CT和CC基因型。CHO等[19]研究发现FABP4基因220A>G (I74V) 和348+303T>C 位点与牛体内脂肪酸沉积和背膘厚显著相关。MICHAL等[20]研究发现牛FABP4基因g.7516 GA位点与延边黄牛的水分含量、脂肪含量以及蛋白含量呈现不同程度的相关性(P<0.05)，但与大理石花纹没有发现显著相关性，可能是样本数量或遗传背景不同的影响。综上所述，FABP4基因可以作为延边黄牛肌内脂肪沉积和肉质性状的候选基因。

FABP4基因在延边黄牛不同的组织中的表达量也不同，表达水平从高到低依次为心脏、背最长肌、后腿肌、脾脏、肝脏、肺脏、肾脏，且心脏的表达量极显著高于脾脏、后腿肌、肺脏、肝脏和肾脏。后腿肌组织中FABP4 mRNA表达量与IMF含量呈显著正相关，与背最长肌组织中IMF含量极显著正相关。在FABP4基因还发现g.3691 G>A突变位点，该位点与延边黄牛水分含量、脂肪含量、蛋白含量显著相关。因此该基因可以作为延边黄牛肌内脂肪沉积和肉质性状的候选基因。