河北省貉子毛滴虫感染情况调查及超微结构观察

柳 佳，梅汝蕃，李永秀，潘素敏，杜义明，陈丽凤，史秋梅，张西臣，刘 璐，王秋悦*

(1.河北科技师范学院 动物科技学院 河北省预防兽医重点实验室，河北 秦皇岛063000；2.吉林大学 动物医学学院，吉林 长春 130062；3.河北科技师范学院 化学工程学院，河北 秦皇岛 063000)

毛滴虫属原生动物门、动物鞭毛虫纲、毛滴目、毛滴虫科、毛滴虫属，是一种致病性原虫，拥有广泛的宿主，包括人类以及非人类的灵长类动物等[1]。大多数寄生于犬科动物的毛滴虫为人五毛滴虫，是一种人兽共患原虫，寄生在肠道内并引起动物腹泻、呕吐等症状。

近年来，国内外陆续出现在幼犬腹泻粪便中观察到毛滴虫的报道[2-3]。在动物中，尤其是毛皮动物中，人们对毛滴虫所造成危害的认识是远远不够的，国内外对毛皮动物体内毛滴虫的研究报道甚少[4]。河北省是毛皮动物养殖大省，貉子养殖占有重要的经济地位，近年来笔者发现由毛滴虫感染引起毛皮动物腹泻的病例大量增加，但常被误诊为细菌或病毒感染，导致用药不当，延误治疗，造成较大经济损失。因此对滴虫病的研究与防治工作的重要性日益突出。

我们之前的研究对貉子体内分离出的毛滴虫进行了分子生物学鉴定，发现其是由人体内的毛滴虫感染所致[4]。毛皮动物毛滴虫感染存在着较大人兽共患的风险，具有重要的公共卫生学意义，应当加以足够的重视并进行深入研究。为此，我们于2015年6月—2017年8月对河北省部分地区貉子毛滴虫的感染情况做了调查统计，并对毛滴虫超微结构进行了观察。以期为河北省地区貉子养殖业毛滴虫病的防治工作提供大量的数据依据。

1 材料与方法

1.1 材料采集及主要试剂取自2015年6月—2017年8月送至河北科技师范学院动物医院的河北各地区毛皮动物腹泻病例680例。青霉素、硫酸链霉素、碘液、瑞氏染液、无水乙醇、三氯化铁、RPMI1640培养基等试剂均由河北省预防兽医重点实验室提供。

1.2 毛滴虫直接镜检法于棉签取腹泻貉子的粪便少量，涂抹于载玻片上，滴加1滴生理盐水，盖上盖玻片在显微镜下观察，看是否有滴虫感染并记录下滴虫的形态特征。

1.3 虫体的分离与培养用无菌棉签刮取适量肠黏膜物，然后将棉签放入灭菌10 mL离心管中，在管中加入RPMI1640培养液8.0 mL，青链霉素双抗(104U/mL)溶液1.0 mL，胎牛血清1.0 mL，置于37℃恒温培养箱中培养，36 h后传代，连续培养数天至虫体生长趋于稳定，以备后用。

1.4 虫体染色观察取培养48 h的虫液3 mL，2 500 r/min 离心5 min，取沉淀，再加入0.5 mL PBS溶液并吹吸均匀，然后吸取200 μL虫液于载玻片上做45推片，自然晾干备用。吸取适量瑞氏染色液均匀覆盖在待染色载玻片上，30 s后用水缓缓冲洗，常温晾干并及时镜检。

1.5 虫体体外冻存复苏试验将处于对数生长期时的虫体悬液转移至5 mL EP管中。为比较已报道的两种常用的原虫离心条件的优劣，将待冻存的10管虫体分为A、B 2组，每组5管。A组离心条件设定为3 000 r/min，离心10 min。B组离心条件为2 000 r/min，离心10 min。然后加入900 μL RPMI 1640完全培养基吹吸重悬后加入100μL DMSO冻存保护剂并混匀转移至冻存管中，液氮保存。复苏时将冻存管取出后立即进行37℃恒温水浴。将融化后虫体悬液移至新鲜37℃ 1640完全培养基中，分别于培养后第0，6，12，24，48，54，60 h观察并记录虫体生长情况。

1.6 虫体超微结构观察将复苏纯化好的虫体转移至1.5 mL离心管中，2 000 r/min离心5 min，弃上清后沉淀用37℃ PBS重悬，2 000 r/min离心5 min，弃上清，沉淀中加入1 mL 2.5%戊二醛固定液，将沉淀吹吸混匀，于4℃固定，将样品送至电镜室，制样后在扫描电镜和透射电镜下观察虫体的表面、细胞核、鞭毛、盾膜、轴杆、波动膜、过氧化氢酶体、高尔基体、内质网等超微形态结构。

1.7 貉子毛滴虫感染情况统计分析对貉子粪便镜检毛滴虫感染阳性的病例进行统计，分析其在季节分布、性别分布、年龄分布等的差异。

2 结果

2.1 貉子临床剖检变化腹泻貉子有的表现为食欲不振，精神萎靡，死前有不吃食现象，偶见伴有呕吐现象，均有腹泻症状，粪便颜色深浅不一，有的病例为暗绿色或黑色，有的病例为黄白色稀便。剖检病变为有的病例整个肠黏膜出血严重，盲肠有溃疡；有的病例病变仅限于盲肠，盲肠肿大为普通的2倍以上。

2.2 直接镜检直接镜检法可在低倍镜下可见大量快速游动的虫体，呈螺旋状前进或是原地做圆圈运动。高倍镜下可见卵圆形或梨形半透明虫体，部分虫体有1～4根不等的鞭毛。

2.3 虫体染色瑞氏染色可见虫体呈梭形，细胞质被染成淡蓝色，细胞核被染成深紫色，核质分界清晰，前后鞭毛清晰可见(图1)。

图1 毛滴虫瑞氏染色观察(400×) A.前鞭毛；B.独立鞭毛

2.4 复苏结果以DMSO做冻存保护剂对培养的虫体进行了冻存实验。冻存实验所用的虫体在从培养基取出后进行计数，计数后用1640完全培养基将虫体悬液调整为1.5×106个/mL的初始密度。A组离心条件设定为3 000 r/min，离心10 min。B组离心条件为2 000 r/min，离心10 min。其他条件保持不变，冻存6个月后进行复苏，将复苏后的虫体转入新鲜培养基培养，分别于培养后第0,6,12,24,48,54,60 h进行观察并计数，计数结果见表1，根据此绘制虫体生长曲线见图2，结果发现B组培养基内的虫体数量明显多于A组。因此虫体冻存时选择了2 000 r/min离心10 min，以备后用。

表1 虫体复苏结果 虫体密度：×1000个/mL

图2 毛滴虫复苏后生长曲线

2.5 虫体超微结构观察根据扫描电镜的形态学观察如图3显示，毛滴虫大小为(5～10) μm×(4～8) μm,该细胞共有5根鞭毛：4根前鞭毛以及1根后鞭毛，具有独立鞭毛的特征性形态结构。借其前端4根鞭毛摆动前进，并以波动膜波动作螺旋式运动。后鞭毛从虫体前端盾膜处发出后与波动膜伴行，至虫体后端游离出来。虫体后部可见轴杆。

图3 扫描电镜和透射电镜观察虫体 a,b,c.为扫描电镜照片;d,e,f.为透射电镜照片；AF.前鞭毛1-4；IF.独立鞭毛；UM.波状膜；P.核；AX.轴；A.高尔基体；B.细胞核；C.氢化体；D.轴杆；E.食物泡；F.前鞭毛；G.后鞭毛；H.独立鞭毛；I.细菌

透射电镜观察发现虫体由双层质膜包围，体前1/3有1椭圆形细胞核；核膜外周可见高尔基体、氢化体、高尔基体、食物泡、轴杆。1根轴杆，纤细透明，纵贯虫体，自后端伸出体外。体外侧前1/2处，有1波动膜，其外缘与向后延伸的后鞭毛相连。从超微结构观察，无完整的线粒体，此与其他原虫有很大不同，无厌光性及嗜光性，通电偏向阴极。而且我们意外发现虫体内有肠杆菌存在(I)。

2.6 腹泻貉子体内毛滴虫感染本研究共检测680份腹泻粪便样本，毛滴虫感染阳性检出数为364份，感染率为54%。在6-10月份毛滴虫感染数量明显多于其他月份(图4)。夏秋两季毛滴虫感染率较高，表明毛滴虫更适宜在温度较高的环境中生长繁殖。养殖户应注意加强夏秋两季滴虫病的预防工作。不同性别貉子感染毛滴虫情况见表2，其中公貉子感染率为50.8%(215/423)，母貉子感染率为58.09%(149/257),经χ2检验，不同性别貉子毛滴虫感染率差异不显著(P>0.05)。不同月龄貉子感染毛滴虫情况中，2月龄以下毛滴虫感染阳性率为59.4%(199/335)，2月龄以上毛滴虫阳性率为47.8%(165/345)，2月龄以下貉子感染毛滴虫阳性率明显高于2月龄以上貉子，而且患病临床症状也较为明显，经χ2检验，各年龄段之间毛滴虫感染率差异极显著(P<0.05)。

图4 2015年6月至2017年8月不同月份腹泻貉子毛滴虫感染情况

表2 貉子不同性别、年龄毛滴虫感染情况

3 讨论

目前国内外对于毛滴虫的研究主要集中在致病性较强的阴道毛滴虫和胚胎三毛滴虫上，而对于常发生在犬、狐、貉等犬科动物身上的人五毛滴虫的研究相对较少[1,4]。过去通常认为人五毛滴虫是宿主肠道内共生的原生动物，然而近年陆续出现从不同宿主动物中检测出人五毛滴虫的报道。比如BASTOS等[5]在慢性腹泻病例的幼猫粪便中发现人五毛滴虫的感染，LI等[6]对中国东北地区的832只绵羊和781只山羊新鲜粪便做了人五毛滴虫的流行病学调查，发现有2只山羊粪便中感染人五毛滴虫，LI等[7]对吉林省6种野生养殖动物进行了人五毛滴虫的流行病学调查，发现梅花鹿、獭兔、蓝狐、银狐、貉子、水貂的感染率分别高达20%，16.25%(13/80)，45%(27/60)，43.33%(26/60)，53.33%(32/60)和48.33%(29/60)。LI等[8]对中国北方的犬、猴子进行了人五毛滴虫感染的流行病学调查，发现感染率分别是27.38% (69/252)和46.67% (28/60)。GOOKIN等[9]在腹泻犬中检测到人五毛滴虫的存在，并证实其有致病性。笔者前期通过体外分离培养和PCR分子鉴定首次对我国貉源毛滴虫进行了初步鉴定，发现其与人五毛滴虫处于同一进化分支，亲缘关系较近[4]。由于人五毛滴虫的宿主广泛性以及人畜共患的特性，对毛滴虫在毛皮动物的深入研究愈发重要，尤其是明确其生物学特性及公共卫生影响更有价值和参考意义。

河北省毛皮经济动物养殖数量巨大，貉子的发病率逐年增加，本研究结果显示，患腹泻病貉子普遍存在毛滴虫感染，共检测腹泻貉子680只，毛滴虫感染率高达54%(364/680)。说明河北省内貉子滴虫感染情况较为普遍。这可能与养殖户对毛滴虫感染缺乏了解和重视，驱虫工作不到位、不彻底或驱虫药的选择有关。调查中发现，大多数养殖户家中圈舍卫生状况较差，粪便不能够及时清除或清扫的粪便和污物未能及时清理出圈舍，较长时间堆放在圈舍，使得感染毛滴虫的几率增加。从调查结果看，毛滴虫感染一般在6-10月份出现高峰，而在1-5月份和11-12月份感染数不高，说明滴虫适宜在温度较高的环境中生长繁殖。提醒养殖户更应注意加强夏秋两季毛滴虫病的防控。

本研究在对分离得到的虫体进行扫描电镜观察时发现，观察到的虫体出现皱缩现象，而不是光滑的，原因可能是制片过程中对切片进行脱水的环节，切片脱水过快或前期固定不充分，导致虫体出现皱缩。也可能是由于制片过程中用多聚赖氨酸单位数较小，导致活性强的虫体没有牢固固定在玻片上，但是这并不妨碍我们对毛滴虫超微结构的观察，虫体的前鞭毛和独立鞭毛形态清晰可见。而且我们在偶然的一次制片中看见了毛滴虫体内竟然有肠杆菌的存在，他们之间关系如何？是否可将细菌作为毛滴虫的治疗载体？我们将进一步对毛滴虫的致病机理开展深入研究，以期为毛滴虫的治疗开辟新的途径和方法。