锡兰钩虫谷胱甘肽-S-转移酶基因的克隆表达与免疫原性分析

杭建雄，黄 岳，颜欣欣，刘云秋，赵 琪，何 龙，冉荣坤，李 秀，刘菊枚，李国清

(华南农业大学 兽医学院，广东 广州 510640)

钩虫病是一类被忽视的重要人畜共患寄生虫病，锡兰钩虫是唯一一种可在人体内发育为成虫并能引起人的腹泻、贫血等症状的动物源性钩虫[1]。定期服用驱虫药是目前治疗钩虫病的主要方法，但由于钩虫的反复感染以及长期用药后对药物产生的抗药性，导致药物防治未能取得良好效果[2]。因此，迫切需要探索控制钩虫感染的新方法。

谷胱甘肽-S-转移酶(glutathione-S-transferase，GSTs)是与细胞解毒与抗氧化有关的一种多功能酶，也是蠕虫主要解毒酶之一。GSTs 不仅对内源性或宿主产生的有毒产物发挥重要的解毒作用，而且还可作为抗寄生虫感染的疫苗候选分子或药物靶标[3-4]。据报道，美洲板口线虫GSTs可参与吸血过程中血红素的解毒，用GSTs重组蛋白免疫金黄仓鼠可对钩虫的攻击感染产生保护性免疫，其中Na-GST-1已被遴选为抗人类钩虫感染的候选疫苗[5]。目前，在锡兰钩虫成虫肠道转录组中共鉴定出13种GSTs，其中编号为ANCCEY-00737的GST与Na-GST-1的相似性最高[6]，具有较高的研究价值，但近几年国内外却鲜有相关的报道。本研究旨在对该蛋白编码基因进行克隆表达与序列分析，并研究其对昆明小鼠的免疫原性，以便了解锡兰钩虫GST分子的致病作用和免疫学特性，为该病疫苗候选分子或药物靶标的筛选奠定基础。

1 材料与方法

1.1 虫体及菌株虫体采自广州华南农业大学外科实验室的实验犬，根据FU等[7]的方法鉴定虫种后置于RNA样品保存液中-20℃保存。大肠杆菌DH5α和克隆载体pMD18-T购自大连TaKaRa公司；大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞购自上海Sangon生物工程公司；表达载体pET-32a由华南农业大学寄生虫教研室保存。

1.2 主要试剂限制性核酸内切酶EcoRⅠ、BamHⅠ为大连TaKaRa公司产品；弗氏佐剂为上海Sangon生物工程公司产品；犊牛血清、刀豆蛋白、RPMI 1640培养基、细胞筛均购自广州市凯阁生物科技有限公司。

1.3 引物设计根据GenBank上锡兰钩虫GST基因序列(ANCCEY_00737)设计1对特异性引物，GST-AF(5′-GGATCCATGAGTAA GCGACATCAAGC-3′)和GST-AR(5′-GAATTCTCAGAAGGT GGAGCTCGGT-3′)，下划线部分分别为BamHⅠ与EcoRⅠ酶切位点。

1.4 锡兰钩虫GST基因扩增与重组表达质粒的构建采用Omega microElute Total RNA Kit试剂盒提取锡兰钩虫成虫总RNA，用反转录试剂盒合成GST cDNA第1链。以GST-AF/GST-AR为引物，RT-PCR扩增锡兰钩虫GST基因。将PCR产物插入pET-32a表达载体，转至E.coliDH5α中，涂布于含有氨苄青霉素(50 mg/L)的LB平板上，37℃培养过夜，按照质粒抽提试剂盒抽提重组质粒，双酶切鉴定，阳性克隆送至武汉天一辉远生物科技有限公司测序。

1.5 锡兰钩虫GST基因的序列分析利用DNAMAN6.0.3.99软件翻译锡兰钩虫Ace-GST基因的氨基酸序列；利用MegAlign7.1.0软件将Ace-GST与其他GST氨基酸序列进行同源性比对；利用MEGA5.05将Ace-GST氨基酸序列与从NCBI下载的13个GST氨基酸序列(图2)采用邻接法(neighbor-joining，NJ)构建系统进化树。

1.6 重组蛋白的表达与纯化将重组表达质粒转入E.coliBL21中于37℃振摇培养至D600为0.6～0.8，加IPTG(1.0 mmoL/L)培养6 h。菌液经超声破碎，分别收集上清与沉淀，用SDS-PAGE分析重组蛋白在菌体中的分布。收集超声破碎上清，采用镍柱纯化法纯化重组蛋白。

1.7 抗GST多克隆抗体的制备30只6周龄昆明小鼠随机均分为重组蛋白组(A组)和佐剂对照组(B组)。A组注射重组蛋白Ace-GST，抗原与佐剂乳化后，腹腔多点注射，每次免疫剂量为100 μg/只，间隔2周1次，共3次。B组以PBS代替免疫抗原，同法免疫小鼠。小鼠于免疫前、每次免疫后2周、4周眼缘静脉采血，每组5只，血样 37°C放置 1 h 后，转移 4°C冰箱过夜静置析出血清，5 000 r/min 离心 10 min，收集血清，-70℃保存备用。

1.8 重组蛋白的Western blot分析取10 μg重组蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳；电泳后分别用His-Tag小鼠单克隆抗体(1∶5 000)、免疫鼠血清(1∶1 000)进行Western blot分析。并使用二氨基联苯胺(DAB)显色。

1.9 免疫鼠脾淋巴细胞增殖试验(MTT法)末次采血后，小鼠脱颈处死，无菌取脾，制备脾淋巴细胞悬液。参照文献[8]的方法进行MTT试验，计算淋巴细胞刺激指数(试验孔D490值/对照孔D490值)，采用SAS 9.0统计软件分析实验数据。

2 结果

2.1 GST基因的扩增及重组表达质粒的鉴定RT-PCR扩增结果显示，在468 bp左右呈现1条特异性条带(图1)，与预期片段大小相符。重组表达质粒pET32a-Ace-GST的双酶切鉴定结果显示，在468 bp处有目的条带(图2)，与预期片段大小一致。

图1 Ace-GST基因的扩增图 M.DL2000 Marker；1.目的基因

图2 重组表达质粒双酶切鉴定 M.DL2000 Marker；1.重组质粒

2.2 Ace-GST基因序列分析锡兰钩虫Ace-GST基因全长为468 bp，编码155个氨基酸。犬源锡兰钩虫Ace-GST基因所编码的氨基酸序列与锡兰钩虫 ANCCEY_00737(EPB80182.1)的同源性为100%。进化树显示，犬源锡兰钩虫Ace-GST与ν类GSTs聚为同一分支，其他不同亚家族的GSTs各自聚成不同类群(图3)。

图3 不同物种GST以NJ法构建的系统进化树 ●为目的蛋白

2.3 重组蛋白的表达产物与免疫原性分析重组蛋白的表达产物经SDS-PAGE检测的结果见图3。结果显示在约36 000(pET32a载体蛋白大小约为20 000)处可见明显条带，与预期蛋白分子质量一致；可溶性分析结果显示，该蛋白主要存在于裂解物的沉淀中。250 mmol/L咪唑溶液洗脱时，在36 000 左右处获得了大量重组蛋白，蛋白浓度为0.521 g/L。Western blot结果显示，该重组蛋白抗原均能被His-Tag 鼠单克隆抗体和抗重组蛋白免疫血清所识别(图4)。经ELISA检测，免疫后小鼠IgG抗体效价高达1∶204 800。

图4 重组蛋白的SDS-PAGE M.蛋白分子质量标准；1.诱导重组菌pET32a-Ace-GST表达产物；2.诱导重组菌pET32a-Ace-GST上清；3.诱导重组菌pET32a-Ace-GST沉淀；4.纯化的pET32a-Ace-GST蛋白

2.4 昆明鼠淋巴细胞增殖试验(MTT)免疫小鼠淋巴细胞增殖试验结果见表1。结果显示，免疫组平均刺激指数2.60±0.06明显高于PBS对照组1.05±0.03(P<0.05)，表明该重组蛋白显著刺激免疫小鼠脾淋巴细胞的增殖。

图5 Western blot分析 M.蛋白分子质量标准；1.与His-Tag鼠单克隆抗体反应；2.与抗重组蛋白免疫血清反应

表1 免疫小鼠脾淋巴细胞增殖试验结果(D490 nm)

3 讨论

谷胱甘肽-S-转移酶(GST)是由多个基因编码、具有多种功能的同工酶，广泛分布于各种生物体内[3]。GSTs不仅可以作为酶类催化一系列有毒分子与谷胱甘肽反应，参与白细胞三烯的转化、H2O2降解、Michael(迈克尔)加成反应，还可作为配体结合蛋白俘获有毒物质[9-10]。游离血红素是吸血寄生虫血红蛋白消化过程的终末产物，对其虫体具有潜在毒性。钩虫与其他吸血寄生虫(如疟原虫)类似，也已进化出对游离血红素的解毒机制，即通过表达线虫特有的ν类GSTs，使其对过氧化氢酶的亲和力相对于其他种类的GSTs降低，但结合游离血红素的能力提高[11]。本研究首次克隆表达锡兰钩虫Ace-GST基因，序列分析表明Ace-GST与Na-GST-1和Ac-GST-1类似，同属于ν类GSTs。

研究表明，美洲板口线虫Na-GST-1与佐剂Alhydrogel配伍的疫苗具有一定的免疫保护效果[ 12 ]。其作用机制可能是诱导产生的IgG可阻断钩虫GST的解毒作用，从而导致游离血红素的积累而损害虫体。当用重组GSTs免疫时，宿主产生相应的中和抗体，干扰虫体GSTs对血红素的解毒，导致虫体死亡或降低其繁殖能力。据报道，用犬钩虫Ac-GST-1免疫犬可产生明显的免疫保护作用，肠道寄生的虫体及粪便中虫卵数量均显著减少[13]。此外，Na-GST-1还可诱导金黄仓鼠产生抗钩虫感染的保护性免疫，其减虫率可达40%[5]。本研究用弗氏佐剂乳化的Ace-GST免疫昆明小鼠，对免疫鼠获得的抗血清进行ELISA测定，结果显示抗血清效价高达1∶204 800，IgG水平明显升高，表明该重组蛋白抗原可诱导小鼠产生特异性抗体，具有较好的免疫原性。淋巴细胞增殖实验( MTT) 是反映细胞免疫功能的传统方法，其刺激指数大于1.5时，判定为有效刺激;数值越大,说明所免疫细胞群体的反应能力和免疫功能越强。在本研究中，免疫组昆明小鼠淋巴细胞刺激指数均大于1.5(2.6左右)，且明显高于对照组(P<0.05)，表明该重组蛋白能够促进免疫小鼠脾淋巴细胞的增殖。上述结果表明，Ace-GST可诱导昆明小鼠产生特异性抗体和致敏淋巴细胞，提示Ace-GST蛋白可能是一种具有抗钩虫疫苗潜力的候选分子。