宁夏部分地区奶牛犊牛隐孢子虫感染情况调查

高海慧，施 安，张立强，厉 龙，王培柱，吴学青，康晓冬

(1.宁夏农林科学院 动物科学研究所，宁夏 银川 750002；2.宁夏农垦贺兰山奶业有限公司，宁夏 银川 720002；3.宁夏石嘴山市惠农区动物疾病预防控制中心，宁夏 平罗，753200；4.宁夏吴忠市利通区扁担沟镇畜牧兽医工作站，宁夏 吴忠 751100)

隐孢子虫是一种细胞内和胞质外的寄生虫，引起胃肠道功能紊乱导致幼畜和免疫功能不全人群的腹泻[1]。隐孢子虫是一种人兽共患致病原虫[2]，广泛寄生在多种动物的消化道，病原体有直接的生命周期,可以在受感染动物的胃肠道上皮细胞繁殖[3]，呈多国家多地区分布。无论是健康的还是腹泻的一月龄以下犊牛可能存在传递隐孢子虫的危险性[4]。通过卵囊污染的食物、饮用水、器具等传播，新生犊牛免疫机制不完善，感染牛只可能引起严重腹泻甚至导致死亡，同时会给人类带来隐孢子虫病的隐患。至今，世界上还没有有效的药物治疗该病。

奶牛是宁夏的支柱产业，现有奶牛存栏量40.15万头[5]，近年来关于宁夏犊牛隐孢子虫分子特性鲜有报道，据此，为了初步明确宁夏地区犊牛感染隐孢子虫的分子特性，本研究从8个规模化奶牛场，分年龄采集犊牛粪便，提取DNA，以隐孢子虫18S rRNA基因位点进行分析，进行感染情况调查和虫种鉴定，以期对犊牛隐孢子虫的防治提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 粪便样品的采集2018年4月—2019年5月从宁夏3市采集样品272份，用采便器直肠取样，标记年龄，地点，日期等信息放入冰盒送回实验室4℃保存，3～5 d内提取粪便基因组DNA。

1.2 样品DNA提取按照天根公司的粪便基因组DNA提取试剂盒提取DNA，标记详细，分装2份置于-20℃ 保存备用。

1.3 PCR引物的合成利用基于隐孢子虫18S rRNA基因位点的引物，参照文献[6]的记载，第1轮PCR的上游引物：5′-TTCTAGAGCTAATACATGCG-3′;下游引物：5′-CCCTAACCTTCGAAACAGGA-3′，第2轮PCR的上游引物：5′-GGAAGGGTTGTATTTATTAGATAAAG-3′;下游引物：5′- CTAATAAGGTGCTGAAGGAGTA-3′，引物由上海生物工程有限公司合成。

1.5 样品PCR扩增反应体系：第1轮PCR反应：25 μL反应体系，2.0 μL dNTP(2.5 mmol/L)，2.5 μL10×Buffer，2.0 μL MgCl2(25 mol/L)，0.125 μL Ex-Taq酶(5 U/ μL)，上下游引物各1 μL(10 μmol/L)，DNA模板1 μL。第2轮PCR反应为25 μL体系，模板为第1轮PCR产物1 μL，其他同第1轮反应。设置阴阳性对照，含GelRed的1%琼脂糖凝胶电泳，成像观察结果。

1.6 序列测定及虫种鉴定将电泳结果阳性的PCR产物送上海生工生物股份有限公司双向测序。测序结果参照图谱校正后，在GenBank中进行序列比对，确定犊牛感染的虫种。

1.7 种系发育分析在GenBank中查找隐孢子虫的参考序列，利用软件MEGA 5.1进行种系发育关系分析，进一步确定犊牛感染的隐孢子虫虫种。

1.8 数据分析用SPSS 19.0 软件进行卡方检验。

2 结果

2.1 PCR扩增及序列分析基于18SrRNA基因对272份样品进行PCR扩增，结果显示阳性对照、部分样品成功扩增出了大小约为830 bp的片段(图1)。测序结果显示，宁夏地区犊牛隐孢子虫的阳性率为12.88%，存在3种隐孢子虫，分别为牛隐孢子虫(CryptosporidiumC.bovis)、瑞氏隐孢子虫(Cryptosporidiumryanae,C.ryanae)和微小隐孢子虫(Cryptosporidiumparvum,C.parvum)，感染率分别为54.29%，31.43%，20.00%。

图1 部分阳性样品PCR扩增结果 M.DL2000 DNA Marker;1.阳性对照；2～5.阳性样品；6.阴性对照

2.1 不同地区隐孢子虫感染情况试验选取宁夏3个市8家奶牛养殖场，共采集粪便样品272份，发现阳性样品35份，阳性率为16.89%。结果显示：银川市的场感染率高于其他2市，各市之间感染率差异不显著(P>0.05 )，3个市犊牛感染的优势虫种都是C.bovis，感染率分别为52%，60%，60%(表1)。

表1 不同地区犊牛隐孢子虫感染情况

2.2 断奶前后犊牛隐孢子虫感染情况试验分别采集断奶前、断奶后样品各99份、173份。研究发现断奶前犊牛感染率(14.14%)，高于断奶后犊牛(12.14%)，断奶前与断奶后感染率差异不显著(P>0.05 )。断奶前犊牛是C.bovis感染率最高，断奶后犊牛是C.bovis和C.ryanae感染率相同，2个阶段C.parvum的感染率均最低(表2)。

表2 断奶前后犊牛隐孢子虫感染情况

2.4 种系发育分析构建系统进化树结果说明：35份犊牛阳性样品中，19个与Genbank数据库中的C.bovis位于同一进化枝上，11个与C.ryanae位于同一进化枝上，5个与C.parvum位于同一进化枝上，表明研究获得3种虫种，其中C.bovis的感染率最高，且3个市都发现C.bovis的感染，每市感染率差异不显著(P>0.05 )，断奶前与断奶后犊牛都发现C.bovis的感染。

图2 基于隐孢子虫18S rRNA基因的种系进化树

3 讨论

奶牛产业是宁夏的主导产业之一，宁夏地域面积小，奶牛存栏量大，是我国著名的优质奶生产基地。牛的各种传染病、寄生虫病给奶牛产业带来了很大威胁，严重制约我区养殖业的持续稳步上升。牛是哺乳动物中普遍感染隐孢子虫的一种，断奶前犊牛是人畜共患病重要的直接宿主。犊牛隐孢子虫病呈世界性分布，但感染率存在较大差异，我国多省市已有报道，感染率为1.0%～48.5%[2,7-10]。本研究结果显示，宁夏3个地区隐孢子虫的感染率为9.62%～16.89%，感染率差异不显著，说明选取的调查地点无地区差异。犊牛隐孢子虫的感染率为16.89%，在我国处于中等偏下水平，断奶前犊牛感染率为14.14%(14/99)，高于宁夏地区奶牛犊牛酶联免疫吸附试验检测的阳性率8.75%(7/80)[11]，原因可能是检测方法、采样地区、采样时间的不同。

牛的隐孢子虫虫种常见的有C.parvum,安氏隐孢子虫(C.andersoni),C.bovis和C.ryanae[12]，4个虫种的检出与年龄有关，C.parvum在断奶前犊牛中检出率高，尤其是伴随腹泻的犊牛[13]，我国C.bovis的检出率高于C.parvum[2,14-16]。本研究说明，宁夏地区奶牛犊牛感染了C.bovis，C.ryanae和C.parvum，其中C.bovis检出率最高，与我国C.bovis是优势虫种一致，人兽共患的C.parvum为5株，存在人兽共患风险。我国安氏隐孢子虫为断奶后犊牛的优势虫种[15-17]，本研究中断奶前断奶后犊牛都没有分离出安氏隐孢子虫。DAZ等[4]回归分析表明，15～21 d的犊牛更容易感染隐孢子虫。

本研究结果表明，宁夏奶牛犊牛隐孢子虫的感染较普遍，存在3个虫种的感染，分离到人兽共患的C.parvum5株，需要引起重视，牧场应该加强防范意识，对隐孢子虫病定时监测，尽努力阻断隐孢子虫的传播，为该病的有效控制打下基础。