西安某动物医院门诊猫毛滴虫病的调查与分析

王品雪，张金凤，马 丽，姚 倩，林 青,2,3*

(1.西北农林科技大学动物医学院，陕西杨凌 712100；2.家畜疫病病原生物学国家重点实验室(中国农业科学院兰州兽医研究所)，甘肃兰州 730046；3.青海大学省部共建三江源生态与高原农牧业国家重点实验室，青海西宁 810016)

人五毛滴虫(Pentatrichomonashominis)和胎儿三毛滴虫(Tritrichomonasfoetus)是引起猫毛滴虫病的两种主要病原，其中以胎儿三毛滴虫更为常见。Levy G M等[1]首次通过分子生物学方法确定了胎儿三毛滴虫为猫毛滴虫病的病原。感染胎儿三毛滴虫的猫可出现淋巴浆细胞性、中性粒细胞性结肠炎和慢性恶臭大肠性腹泻[2]，一些幼猫甚至会出现大便失禁[3]。胎儿三毛滴虫可寄生于多种宿主的不同部位，虫体通过粪-口途径传播[2]。猫胎儿三毛滴虫的感染率视检测方法而定，在2%～82%范围内不等[4-8]。感染胎儿三毛滴虫并出现腹泻症状的猫多为幼猫，年龄范围为1月龄至16岁不等[2,9]。人五毛滴虫宿主范围广泛，定殖于多种脊椎动物的肠道内，呈世界性分布。人、犬和猫等不同宿主来源的人五毛滴虫均为同一虫种，因而存在人兽共患风险。一般情况下，感染人五毛滴虫并不会出现明显的临床症状，但当宿主体况不佳或免疫力下降时，则会引发胃肠道反应，造成宿主胃肠不适[10-11]。

猫毛滴虫病作为一种临床常见的消化道疾病，可引起猫的腹泻，主要表现为频繁排出少量液态至半成型状态的粪便，通常混有血液和黏膜，排便紧张，对猫的健康带来威胁，已经引起了兽医学领域的重视。近年来，病原性原虫的检测技术得到提升，除了常规化验检测以外，分子生物学技术如聚合酶链反应(Polymerase chain reaction,PCR)技术在临床也得到运用。本研究拟通过分子生物学方法对西安某动物医院门诊猫毛滴虫病的感染情况进行调查，以期为该病的临床诊疗和预防提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 粪便样品来源 样本均来自西安某动物医院2018年-2019年来院就诊猫，总计57份粪便样品，其中春季2份、夏季21份、秋季15份和冬季19份。所有样本均使用采便器直接从就诊动物直肠内取出，保存于生理盐水中，并进行光学显微镜镜检。镜检后剩余样品冷藏运输回实验室，置-20℃冻存备用。

1.1.2 主要试剂 Diff-Quik染色液，珠海贝索生物技术有限公司产品；EZNA®Stool DNA 试剂盒(D4015-02)，OMEGA Bio-Tek公司产品；dNTP Mixture(2.5 mmol/L)、溴化乙锭(Ethidium bromide,EB)、TaKaRa公司产品；TaqDNA Polymerase，康为世纪公司产品；琼脂糖、6×Loading buffer、DNA标准DL2 000等，北京擎科新业生物技术有限公司产品；其他试剂为国产分析纯。

1.1.3 主要仪器 HC-3018高速离心机，安徽中科中佳科学仪器有限公司产品；VORTEX-5涡旋混合器，海门市其林贝尔仪器制造有限公司产品；TC-XP-D型PCR仪，杭州博日科技有限公司产品；DYY-7C电泳仪，北京六一生物科技有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 粪便检查 采集的粪便直接涂片镜检，在光学显微镜下(放大倍数100×40)寻找有无运动的毛滴虫。如未发现运动的虫体，可进行染色镜检。按Diff-Quik染色液操作步骤进行。在光学显微镜下(放大倍数10×1 000)观察结果。

1.2.2 粪便样品DNA提取 冷冻储存的粪便样品解冻后按照OMEGA D4015 E.Z.N.A.®Stool DNA Kit病原检测说明书进行DNA提取，提取后的DNA置于-20℃保存，用于PCR扩增。

1.2.3 引物的设计 参考GenBank公布的人五毛滴虫ITS1-5.8S rRNA-ITS2序列片段(AY758392.1)，用Primer Premier 5设计其特异性内、外侧引物(表1)。参考GenBank公布的胎儿三毛滴虫ITS1-5.8S rRNA-ITS2序列片段(AF466749.1)设计胎儿三毛滴虫的外侧引物，其内侧引物参照文献[12]设计的引物序列(表1)。引物均由北京擎科生物科技有限公司西安分公司合成。

表1 ITS1-5.8S rRNA-ITS2序列片段的引物

1.2.4 毛滴虫套式PCR扩增 PCR反应体系为25 μL：10×PCR buffer(15 mmol/L Mg2+)2.5 μL，dNTP mixture(2.5 mmol/L)2 μL，上、下游引物各1 μL，TaqDNA polymerase(5 U/μL)0.125 μL，DNA模板1 μL，灭菌双蒸水补至25 μL。人五毛滴虫第1轮PCR反应参数为：94℃ 5 min；94℃ 30 s，51.5℃ 30 s，72℃ 1 min，循环30次；72℃再延伸10 min；第2轮PCR反应参数将第1轮中退火温度改为52℃，再次延伸时间改为7 min，其余条件不变。胎儿三毛滴虫第1轮PCR反应参数为：94℃ 5 min；94℃ 30 s，57℃ 30 s，72℃ 1 min，循环30次；72℃再延伸10 min；第2轮PCR反应参数将第1轮中退火温度改为54℃，再次延伸时间改为7 min，其余条件不变。所得PCR产物用10 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定，紫外成像仪观察结果。

1.2.5 DNA测序与分析 将阳性PCR产物送至北京擎科生物科技有限公司西安分公司测序，在NCBI上进行BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，并用MegAlign软件将获得的ITS1-5.8S rRNA-ITS2序列片段与已报道的参考序列进行比对分析，确定虫种。

1.2.6 统计分析 利用SPSS 20.0软件，按照不同季节和猫的年龄、性别、腹泻症状、品种等不同因素对猫毛滴虫的感染率分别进行差异显著性分析，运用卡方检验和费希尔精确检验得出结果，当P<0.01时，差异极显著；P<0.05时，差异显著；P>0.05时，差异不显著。

2 结果

2.1 光学显微镜观察结果

直肠采集的粪便立即在显微镜下镜检，可观察到突进式运动的毛滴虫，虫体呈半透明的水滴样。Diff-Quik染色后放大1 000倍可看到位于虫体一侧的波动膜与细胞核，虫体中部有一与波动膜平行的轴杆，同时可观察到滴虫有4根鞭毛，其中前鞭毛3根，后鞭毛1根(图1)。本次共收集到猫的粪便样品57份，光学显微镜检出毛滴虫阳性样品数为12份，即通过临床光学显微镜检查结果显示，猫的毛滴虫感染率为21.1%。

图1 毛滴虫光学显微镜检查结果(1 000×)

2.2 套式PCR检查结果

用套式PCR分别对人五毛滴虫以及胎儿三毛滴虫ITS1-5.8S rRNA-ITS2序列片段进行扩增，结果与预期相同，即人五毛滴虫片段长度为548 bp(图2)，胎儿三毛滴虫片段长度为348 bp(图3)。

M.DNA标准DL 2 000；N.阴性对照；1～4.粪便样品

M.DNA标准DL 2 000；N.阴性对照；1～5.粪便样品

57份猫的粪便样品经套式PCR检测，结果显示，猫的毛滴虫阳性样品总数为28份，总感染率为49.1%。其中检出人五毛滴虫阳性样品3份，即猫的人五毛滴虫感染率为5.3%；检出胎儿三毛滴虫阳性样品27份，即猫的胎儿三毛滴虫感染率为47.4%；其中有2份样品同时检出了人五毛滴虫和胎儿三毛滴虫，即二者的混合感染率为3.5%(表2)。

表2 猫毛滴虫的感染率

2.3 猫毛滴虫感染情况的影响因素分析

本次检测结果显示，有人五毛滴虫和胎儿三毛滴虫共2种毛滴虫的感染。但由于人五毛滴虫阳性样品数仅有3例，故不做统计分析，仅对胎儿三毛滴虫的感染率进行统计学分析。结果显示，猫胎儿三毛滴虫的感染率在不同季节间存在显著差异(P<0.05)，其中，春季最高为100%，秋、冬季相对较低，分别为33.3%和31.6%。而年龄、性别、腹泻症状和品种因素等均对猫胎儿三毛滴虫的感染率无显著性影响(P>0.05)(表3、表4)。

表3 猫胎儿三毛滴虫感染情况的影响因素分析

表4 猫胎儿三毛滴虫感染情况的品种因素分析

2.4 序列比对分析结果

测序共得到11条胎儿三毛滴虫ITS1-5.8S rRNA-ITS2序列片段，这些片段经Blast和MegAlign软件比对分析，显示与已报道的胎儿三毛滴虫核酸序列相似性高达99%以上(图4)。

3 讨论

本次调查在西安某动物医院就诊的猫中同样也检出了胎儿三毛滴虫和人五毛滴虫，且猫胎儿三毛滴虫的感染率明显高于人五毛滴虫的。调查结果表明，猫胎儿三毛滴虫的感染率在不同季节的差异性显著，其中，春季和夏季的感染率较高，而冬季的感染率最低。虽然受样本量的影响，猫胎儿三毛滴虫易感性与季节的相关性仍需通过更多的调查与研究来明确，但是春季和夏季气候温暖，胎儿三毛滴虫在湿润的粪便中能存活较长时间[2]，这有利于毛滴虫病的传播。对临床病例进行诊断时，也提示有必要基于流行季节做出预判。本次调查结果还表明，年龄、性别、腹泻症状、品种等因素均对猫胎儿三毛滴虫的感染率无显著性影响。无论幼龄猫还是成年猫均可感染胎儿三毛滴虫。感染胎儿三毛滴虫的猫的年龄范围为1月龄至16岁不等[2,9]，本次调查也发现成年猫感染胎儿三毛滴虫。报道称猫胎儿三毛滴虫易感性没有性别倾向性[4,13]。本研究结果也表明，猫胎儿三毛滴虫的感染率与猫的性别之间无显著性关联。腹泻是猫毛滴虫病的一项主要临床表现，关于胎儿三毛滴虫感染的报道多是基于患猫出现腹泻症状后进行检测[4,14-15]。有报道称，腹泻症状与猫胎儿三毛滴虫感染存在联系[16-17]，也有报道称猫胎儿三毛滴虫感染与粪便状态无显著联系[5,8]。本次调查显示，猫腹泻表现与感染胎儿三毛滴虫无显著性关联，考虑到样本数量相对较少的因素，建议后续做进一步的调查研究。关于品种因素，纯种猫群有感染率较高[18-19]，但纯种猫和混血猫都可能感染胎儿三毛滴虫[13]。本次调查的结果同样显示，不同品种的猫对胎儿三毛滴虫的感染率无显著性差异。

胎儿三毛滴虫和人五毛滴虫是毛滴虫中的两个重要种类，均可寄生于多种动物和人类，尤其在与人们关系最为密切的伴侣动物犬和猫中常见。尽管这两种毛滴虫感染后多呈亚临床感染，但无论是考虑保护动物健康，还是关注人兽共患病的潜在传播风险，均需要引起人们的高度重视。