miR-203a-3p通过靶向调控GATA6抑制食管鳞癌细胞的增殖和侵袭

殷彩桥，方呈祥，陈 婷，黄 慧，郑 轶，谭家武，张继乔，张 辉

1.湖北民族大学附属民大医院消化内科，湖北 恩施 445000；

2.湖北民族大学附属民大医院肿瘤科，湖北 恩施445000

食管癌发病率和死亡率分别位于全球肿瘤的第8位和第6位，严重威胁着人类的生命和健康。食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）是食管癌的主要病理分型，在发展中国家，食管癌患者中约80%属于ESCC，高死亡率与临床诊断时病情已属于晚期有关，中国是ESCC的高发地区［1-2］。微小核糖核酸（micro-ribonucleic acids，microRNAs，miRNAs）是一种包含19～22个核苷酸的进化保守的小的非编码单链RNA，通过碱基配对在其目标信使RNA（messenger RNA，mRNA）的3’未翻译区域（3’-UTR），参与调节不同细胞增殖、侵袭、迁移和凋亡等重要的肿瘤细胞生物学过程［3-4］。许多miRNAs高度保守，可以通过影响多种靶基因的表达来参与到多种细胞功能途径中，而miRNAs表达的改变和肿瘤发生有关。miRNAs可以作为恶性肿瘤的早期诊断和临床靶向治疗的新的候选者［5-6］。miR-203a-3p是影响上皮细胞生长、分化以及功能的重要分子，并多在上皮源性肿瘤中发挥着防癌、抑癌的作用［7-9］。转录因子GTAT6是高度保守的锌转录因子家族的一员，在早期胚胎发生过程中高表达，在后期胚胎发生过程中定位于内皮细胞，从而在调控细胞分化和老化、器官形成和肿瘤发生、发展中发挥重要作用［10］。不同的miRNAs通过不同的信号通路降低GATA6表达后降低细胞的增殖侵袭能力，影响乳腺癌［11］、食管癌［12-15］等肿瘤的发生、发展过程。我们通过www.mirbase.org和http://mircancer.ecu.edu等工具进行生物信息学分析提示GATA6是miR-203a-3p的潜在靶基因，miR-203a-3p可能通过调节GATA6在ESCC中发挥肿瘤抑制作用。

1 材料和方法

1.1 生物信息学分析和靶基因预测

主要利用www.mirbase.org和http://mircancer.ecu.edu网站以及其他在线工具进行生物信息学分析和miRNAs的靶基因预测。

1.2 细胞培养

ESCC细胞株（KYSE-70和KYSE-180）（由美国约翰斯·霍普金斯大学的Steve Meltzer博士实验室赠送）在RPMI-1640培养液中培养，辅以10%胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）和1%青霉素及1%链霉素，在37 ℃、CO2体积分数为5%的细胞培养箱中培养。

1.3 miRNAs转染实验

将KYSE-70和KYSE-180细胞（2×105细胞/孔）分别种植在24 孔细胞培养板中。在37 ℃、CO2体积分数为5%的的条件下温育24 h，细胞生长达到了70%～80%的培养孔板面积时，使用LipofectamineTMRNAiMAX（购自美国Life Technologies公司）在Opti-MEM无血清培养液（购自美国Life Technologies公司）中将miR-203a-3p模拟物（miR-203a-3p mimic，Cat#4464066，购自美国Life Technologies公司）、miR-203a-3p模拟物阴性对照组（mock，miRVanaTMmiRNA Mimic，Negative Control，Cat# 4464059，购自美国Life Technologies公司）、miR-203a-3p抑制物（miR-203a-3p inhibitor，Cat# 4464084，购自美国Life Technologies公司）、miR-203a-3p抑制物阴性对照组（Inhibitor mock，miRVanaTMmiRNA Inhibitor，Negative Control，Cat# 4464077，购自美国Life Technologies公司）分别瞬时转染到细胞中并继续培养48 h，进行后续实验。

1.4 RNA 提取和实时荧光定量聚合酶链反应（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）检测

用TRIzol试剂（购自美国Invitrogen公司）提取总RNAs，选择TaqManTMMicroRNA反转录试剂盒（购自美国Applied Biosystems公司），用采用miR-203a-3p茎环引物（lot#p179813-000 C03，购自美国Applied Biosystems公司）对RNAs进行反转录后进一步做RTFQ-PCR实验。iScriptTMRT supermix（购自美国Applied Biosystems公司）用于CYBR Green对RNAs进行反转录，iQTM CYBR Green Supermix和GATA6引物（lot#p163274538，购自美国Applied Biosystems公司）分别用作RTFQ-PCR检测。U6和18S作为内参基因。使用QuantStudio Design&Analysis Software进行RTFQPCR分析。

1.5 蛋白质印迹法（Western blot）检测

对KYSE-70和KYSE-180采用瞬时转染miRNAs，分成miR-203a-3p模拟物组和模拟物阴性对照组以及miR-203a-3p抑制物组和抑制物阴性对照组，转染后培养48 h，用磷酸盐缓冲液（phosphate-buffered solution，PBS）洗2次，然后加入含有蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液（购自美国ThermoFisher公司），在冰上放置10 min，在12000×g离心10 min，收集上清液（即蛋白质液），用纳米液滴系统（nanodrop system）测量蛋白质浓度。蛋白质样品煮沸10 min变性，装入十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）（10%）凝胶进行电泳，并转移到PVDF膜（购自美国Millipore公司）上。用5%脱脂牛奶的PBS-T（含0.1%Tween）在室温下对膜封闭30 min，然后加入一抗（兔多克隆GATA6抗体，1∶1000；购自美国ThermoFisherr公司，Cat#PA1-104），在4 ℃温育24 h，PBS-T冲洗后再加入二抗（兔抗IgG 抗体，1∶2000；购自美国Epitomics公司），在37 ℃温育2 h后PBS-T冲洗。用增强化学发光试剂（购自美国Pierce公司）检测信号，在SuperSignal West Pico Chemoluminescence system（美国Pierce公司）检测结合抗体。兔多克隆β-actin抗体（1∶1000；购自美国ThermoFisher公司，Cat#PA1-46296）作为对照组。整个实验操作程序都严格按照试剂盒说明进行。

1.6 细胞存活率分析

将miRNAs转染的细胞种植在96孔（1000个细胞/孔）细胞培养板中，在达到70%～80%的培养孔面积时，在每孔中加入活细胞代谢物还原剂噻唑蓝［3-(4,5-dimethylthiahiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide，MTT］，并在37 ℃、C O2体积分数为5%的条件下温育3 h，然后每孔加入100 μ L 二甲基亚砜（dimethylsulfoxide，DMSO），在37 ℃、CO2体积分数为5%的温育30 min，然后使用ELX800荧光分析仪（购自美国Bio-Tek公司）读取吸光度（D）值。

1.7 细胞体外侵袭能力测定

使用Matrigel基质胶（购自美国BD公司）进行了基底膜基质凝胶细胞体外侵袭能力分析。在每个实验开始之前，将500 μL的放置至室温的无血清的RPMI-1640培养基添加到上室和下室，在37 ℃、CO2体积分数为5%的细胞培养箱中水化2 h，将miR-203a-3p mimics、mock（NC miRmimics）和miR-203a-3p inhibitor、inhibitor-mock（NC miR-inhibitor）转染48 h的细胞种植到上室（16×104个细胞/室）。下室加入含10%FBS的RPMI-1640培养液，在37 ℃、CO2体积分数为5%的细胞培养箱培养48 h。用Diff-Quick staining solution试剂盒按试剂盒要求程序对各组侵袭细胞进行固定，染色，并使用倒置显微镜进行计数。细胞计数在5个不重叠的随机区域进行，计数侵袭细胞。

1.8 双萤光素酶报告实验

将KYSE-70和KYSE-180细胞分别种植在24孔培养板（2×105细胞/孔），使用FuGENE转染试剂（FuGENE Transfection Reagent，购自美国Promega公司）将100 ng的pEZX-GATA6-3’UTR （野生型GATA6：Cat#HimT088468-MT0；突变型GATA6：Cat#CS-HimT088468-MT05-01）与100ng pEZX-miR-203a-3p（野生型miR-203a-3p：Cat#HimR0249-MR04-10，掠夺型pEZX-scrambled，GeneCopoeia）进行联合质粒转染，使用双萤光素酶报告系统（secretepair dual luciferase reporter assay，ThermoFisher，Cat#LF032）检测相对萤光素酶活性，每个样品都是用Glomax仪器（购自美国Promega公司）测定3次。

1.9 FFPE标本微解剖及RNAs提取

为检测miR-203a-3p和GATA6在食管癌患者食管组织的表达水平，对ESCC患者的4%的甲醛溶液固定石蜡包埋（formalin-fixed and paraffin-embedded，FFPE）标本进行微解剖，用ABI RecoverAllTM总核酸分离试剂盒（购自美国Ambion公司）分别提取食管恶性肿瘤组织与异型增生组织总RNAs。

1.10 统计学处理

采用SPSS 19.0软件进行统计学处理。数据以表示，采用双侧Student’st检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-203a-3p在ESCC转染实验中的表达水平

提取转染miR-203a-3p mimics、mock（NC miR-mimics）和miR-203a-3p inhibitor、inhibitormock（NC miR-inhibitor）48 h的KYSE-70和KYSE-180细胞的总RNA，进一步做TaqMan RTFQ-PCR。结果显示，与对照组比较，miR-203a-3p在miR-203a-3p mimics转染组的表达明显升高（P＜0.01），而其表达在miR-203a-3p inhibitor组中明显下降（P＜0.01，图1），提示miRNAs转染成功。

图1 miR-203a-3p在ESCC miRNAs转染实验中的表达水平Fig.1 miR-203a-3p expression in ESCC miRNAs transfection assay

2.2 miR-203a-3p下调GATA6基因的表达水平

提取转染miR-203a-3p mimics、mock（NC miR-mimics）和miR-203a-3p inhibitor、inhibitormock（NC miR-inhibitor）48 h的KYSE-70和KYSE-180细胞的总RNA，进一步做CYBR green RTFQ-PCR检测GATA6的表达水平。结果显示，与对照组相比较，GATA6在miR-203a-3p mimic转染组中的表达水平明显降低，而在miR-203a-3p inhibitor转染组中的表达明显升高，差异均有统计学意义（P＜0.05）。GATA6和miR-203a-3p的表达水平呈反向关系（图2）。

2.3 miR-203a-3p下调GATA6蛋白的表达水平

从转染48 h的培养细胞中提取蛋白质后严格按Western blot检测方法进行操作，用Image J软件对Western blot条带扫描后进行定量和统计学处理。结果显示，与对照相比，GATA6蛋白（45×103）条带信号在miR-203a-3p转染组减弱，而在miR-203a-3p inhibitor转染组中的信号增强（P＜0.05，图3）。

2.4 miR-203a-3p抑制细胞增殖能力

MTT检测结果显示，与对照组相比，在KYSE-70细胞株中细胞增殖能力在miR-203a-3p mimic转染组中下降，而在miR-203a-3p转染组中却升高，其差异有统计学意义（P＜0.05），KYSE-180细胞株中虽然差异无统计学意义，但其趋势却与KYSE-70细胞株一致（图4）。

图2 ESCC miRNAs转染实验中miR-203a-3p下调GATA6的表达水平Fig.2 The expression of GATA6 was down-regulated by miR-203a-3p transfection in the ESCC cell lines

图3 Western blot检测发现miR-203a-3p能降低GATA6蛋白表达水平Fig.3 miR-203a-3p decreased GATA6 protein expression by Western blot assay in ESCC cell lines

图4 MTT检测中miR-203a-3p降低ESCC细胞增殖能力Fig.4 miR-203a-3p decreased cell viability detected by MTT assay in ESCC cells

2.5 miR-203a-3p抑制细胞侵袭能力

使用Matrigel基质胶进行细胞体外侵袭能力实验。结果显示，与对照组相比较，相对侵袭细胞数值/视野在miR-203a-3p mimic转染组中均明显下降（P＜0.01），而在miR-203a-3p inhibitor转染组中KYSE-70细胞株却升高（P＜0.05），差异均有统计学意义（图5）。

图5 miR-203a-3p降低ESCC细胞系的侵袭能力Fig.5 miR-203a-3p decreased invasion in ESCC cell lines

2.6 miR-203a-3p是通过与GATA6的3’-UTR的结合部位直接绑定而起到靶向调控作用

双萤光素酶报告分析结果显示，与miR-203a-3p掠夺型+GATA6野生型组和miR-203a-3p野生型+GATA6突变型组相比，相对萤光素酶活性在miR-203a-3p野生型+GATA6野生型组中明显降低，差异均有统计学意义（P＜0.05）。miR-203a-3p是通过与GATA6的3’-UTR的结合部位直接绑定而起到靶向调控作用（图6）。

图6 miR-203a-3p通过直接绑定在GATA6的3’-UTR而发挥靶向调控作用Fig.6 miR-203a-3p targets GATA6 by directly binding to its 3’-UTR

2.7 食管鳞癌患者恶性肿瘤组织中miR-203a-3p低表达而GATA6高表达

用RTFQ-PCR检测食管鳞癌患者恶性肿瘤组织与异型增生组织中miR-203a-3p和GATA6，与异型增生组织相比较，100%（10/10）食管鳞癌患者miR-203a-3p在恶性肿瘤组织中表达下调，而GATA6的表达水平上调（图7）。

图7 食管鳞癌病人恶性肿瘤组织中miR-203a-3p低表达而GATA6高表达Fig.7 Down-regulation of miR203a-3p and up-regulation of GATA6 in malignant tissues of ESCC patient

3 讨 论

我们的生物信息学分析表明，miR-203a-3p是食管癌的一种肿瘤抑制性miRNAs，GATA6是其潜在的靶向调控基因，本研究目的就是验证我们的假设是否成立。RTFQ-PCR实验发现，与对照组相比，GATA6基因和蛋白的表达水平在miR-203a-3p mimic转染组中明显降低，而在miR-203a-3p inhibitor转染组中却明显升高，差异均有统计学意义（P＜0.05）。进一步Western blot结果显示，与对照组相比，GATA6蛋白（相对分子质量45×103）条带信号在miR-203a-3p转染组中减弱，而在miR-203a-3p inhibitor转染组中的信号增强。RTFQ-PCR及Western blot实验结果一致，证明GATA6和miR-203a-3p的表达水平呈反向关系，在ESCC中miR-203a-3p可明显下调GATA6的表达。miR-203a-3p位于染色体14q32.33的区域，同时也是位于该染色体的一段不稳定的易丢失区域，在许多类型的恶性肿瘤中表达缺失或下调，成熟的miR-203a-3p被认为具有重要的抑癌作用。GATA是基因启动子中一段保守序列，GATA6是GATA家族中的一员，作为转录调节因子，调节中胚层及内胚层来源的细胞分化，在多种肿瘤疾病中成为促癌基因［10-15］。本研究显示，miR-203a-3p mimic转染后的KYSE-70细胞株中细胞增殖生存能力明显下降（P＜0.05），虽然在KYSE-180中差异无统计学意义，但其趋势却与KYSE-70一致。Liu等［16］在胃贲门腺癌中和Chi等［17］在非小细胞肺癌中以及Jiang等［8］在鼻咽癌中的研究均提示miR-203a-3p可以降低肿瘤细胞增殖的作用，本研究结果与以上研究结论一致，miR-203a-3p可抑制ESCC细胞增殖。在临床上不可切除的肿瘤或转移是造成部分患者死亡的原因，本研究的Matrigel基质胶细胞体外侵袭能力实验结果显示，在miR-203a-3p mimic转染组中相对侵袭细胞数值/视野均明显下降（P＜0.01），侵袭细胞显著减少，由此可见miR-203a-3p可降低食管癌细胞的增殖及侵袭能力。这为miR-203a-3p抑制ESCC中的细胞侵袭和转移提供了重要线索。miR-203a-3p抑制细胞侵袭和转移的研究结果在肺癌［18-19］及乳腺癌［20］和食管癌［21］等之中也得到证实。为了证实GATA6的3'-UTR是否为miR-203a-3p在ESCC细胞的功能靶点，进一步测定质粒联合转染细胞中的萤光素酶活性，结果显示，相对萤光素酶活性在miR-203a-3p野生型+GATA6野生型组中明显降低，提示miR-203a-3p是通过与GATA6的3’-UTR的结合部位直接绑定而起到靶向调控作用。另外，本研究检测了10例食管鳞癌患者的食管恶性肿瘤组织与周围异型增生组织中miR-203a-3p及GATA6的表达水平，发现与异型增生组织相比较，100%（10/10）食管鳞癌患者miR-203a-3p在恶性肿瘤组织的表达下调，而GATA6的表达水平上调，进一步印证了我们在细胞水平的研究结果。本研究的不足之处是临床病例数较少，我们将收集更多临床患者标本来进一步验证miR-203a-3p对GATA6的调控作用。综合以上所有实验结果，我们认为miR-203a-3p通过靶向调控GATA6抑制食管鳞癌细胞的增殖和侵袭。