沉默信息调节因子过表达或谷氨酰胺剥夺对肾透明细胞癌细胞凋亡、增殖的影响

复旦大学附属肿瘤医院检验科，复旦大学上海医学院肿瘤学系，上海 200032

肾癌是泌尿系统的常见肿瘤之一，肾透明细胞癌（clear cell renal cell carcinoma，ccRCC）占肾癌的70%～75%［1］。局限性ccRCC手术后尚无标准辅助治疗方案，同时转移性ccRCC无标准的治疗方案，通常采用以内科为主、外科手术为辅的综合治疗，因此寻求新的治疗手段迫在眉睫。谷氨酰胺（glutamine，Gln）是动物组织中重要的氮源。在肿瘤细胞中，Gln代谢处于高水平［2］，也会与宿主细胞竞争血液循环中的Gln，并引起Gln代谢重编程［3］。Gln代谢产生谷胱甘肽、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide phostate，NADPH）等还原性物质抵抗细胞凋亡，抗氧化物质含量的变化会引起微环境的改变，进而影响ccRCC对铂类等细胞化疗药物的敏感性［4］，因此调控谷氨酰胺代谢可成为治疗ccRCC的新手段。

沉默信息调节因子4（silent information regulator 4，SIRT4）位于线粒体基质，调节多种代谢酶活性和参与氧化应激的过程［5］，可以通过ADP-核糖基化抑制谷氨酰胺脱氢酶活性［6］，抑制谷氨酰胺代谢，因此被认为是“glutamine gatekeeper”［7］。现有研究［8］表明，SIRT4作为一个抑癌基因参与肿瘤的发生过程。在人类癌症和小鼠肿瘤模型中发现SIRT4具有肿瘤抑制作用［9-10］。此外，在正常细胞中，DNA损伤时Gln代谢明显降低，通过控制周期停滞来限制危害，但是如果SIRT4缺失或低表达，这种保护性限制将会被打破，促进肿瘤的发生、发展［11］。虽然在SIRT4在肝癌［12］、非小细胞肺癌［13］等癌种中可抑制肿瘤进展，但SIRT4对ccRCC发生、发展的影响尚不清楚，本研究探讨SIRT4是否通过抑制谷氨酰胺代谢影响ccRCC增殖、凋亡。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 细胞系

Caki-2细胞由复旦大学附属肿瘤医院泌尿外科赠送。

1.1.2 主要试剂

抗体SIRT4（sc-135797）、caspase-3（sc-56053）、caspase-9（sc-133109） 购自美国Santa Cruz公司，抗体Bax（50599-2-ig）、蛋白质印迹法（Western blot）二抗（SA00001-1、SA00001-2）购自美国Proteintech公司，蛋白marker（#26616）购自美国Thermo Fisher公司，cocktail（P8340）购自美国Sigma公司，HRP-ECL曝光液（36208ES60）购自上海翊圣生物科技有限公司，酮戊二酸（α-K G，CAS#328-50-7）、青-链霉素（15140122）购自美国Gibco公司，LipofectamineTM2000购自美国Invitrogen公司，PrimeScript®RT reagent Kit购自宝生物工程（大连）有限公司，ROS检测试剂2’,7’-dichlorofluorescein-diacetate（DCFH-DA，HYD0940）、线粒体膜电位检测试剂盒（C2006）购自上海碧云天生物技术有限公司。细胞计数试剂盒（cell counting kit-8，CCK-8）检测试剂（CK04）购自东仁化学科技（上海）有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 SIRT4和SIRT4-H161Y过表达慢病毒液生产

从HEK-293T细胞系中提取RNA，反转录为cDNA后，用相应引物扩增为双链DNA，经双酶切装载于pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro，连同辅助质粒psPAX2、pMD2按照4∶3∶1一起转染HEK-293T细胞，48 h后收取病毒液，0.45 μm滤过器过滤。

1.2.2 稳定细胞株的获得和细胞培养

Caki-2细胞用含有10%胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）的RPMI-1640（购自美国Gibco公司）培养于CO2体积分数为5%、37 ℃的温箱中。利用0.25%胰酶（购自美国Gibco公司）进行细胞传代。用病毒液感染Caki-2细胞24 h后，用1～2 μg/mL的嘌呤霉素筛选1周后获得稳定表达的细胞系。

1.2.3 细胞增殖检测

将细胞以1000个/孔的密度种于96孔板中，在检测时间点更换新的培养基，并在每孔加入10 μL CCK-8检测试剂（CK04），37 ℃温育2 h后，在450 nm波长读取吸光度（D）值。

1.2.4 细胞克隆形成

将细胞按照1000个/孔种于6孔板种，用含有10%FBS的RPMI-1640培养基培养10～14 d后，4%多聚甲醛固定10 min后用1%的结晶紫染色，进行细胞克隆计数。

1.2.5 细胞凋亡检测

Caki-2细胞用0.25%胰酶消化后，400×g离心5 min，用磷酸盐缓冲液（phosphate-buffered solution，PBS）洗涤2次，Annexin V-FITC和碘化丙啶（propidium iodide，PI）染色15 min，用BD流式细胞仪检测凋亡情况。

1.2.6 细胞线粒体膜电位检测

细胞按照2×104个/孔种于24孔板中，用不同培养基培养48 h。取1个孔细胞用CCCP处理30 min作为阳性对照，所有待检测细胞中加入500 μL JC-1工作液处理37 ℃处理30 min，PBS洗涤2次。JC-1单体的激发波长为529 nm，而JC-1二聚体的激发波长为590 nm。通过流式细胞仪或激光共聚焦显微镜检测细胞线粒体膜电位的改变。

1.2.7 NADPH含量检测

当细胞长满约1×106个细胞时，吸净培养液，用移液器加入200 μL的NADP+/NADPH提取液，裂解细胞。13500×g，4 ℃离心5～10 min，取上清作为待测样品备用。配置NADPH标准品和标准曲线，加入检测样品，37 ℃避光温育10 min，终止显色，测量450 nm处的吸光度。

1.2.8 细胞内ROS检测

细胞用10 μmol/L DCFH-DA工作液37 ℃处理30 min，PBS洗涤1次，胰酶消化，BD流式细胞仪用538 nm发射波长检测。

1.2.9 蛋白质印迹法（Western blot）检测

将细胞用IP裂解液加入cocktail和PMSF在冰上裂解30 min，4 ℃ 360×g离心10 min，取上清，用BCA试剂盒（P0010，购自上海碧云天生物技术有限公司）蛋白定量后，加入上样缓冲液，100 ℃煮样5 min。将等量的蛋白样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，通过电印记法转移到PVDF膜上，10%的脱脂牛奶封闭1 h后，按照目的条带大小切割温育一抗4 ℃过夜。第2天用对应属性的二抗室温温育1 h，用HRP-ECL荧光法检测目的蛋白的水平。

1.3 统计学处理

采取GraphPad Prism 6或SPSS 16.0进行统计分析，两组之间比较用t检验，多组之间统计用ANOVA，ROS检测后分析用FlowJo。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SIRT4过表达或Gln剥夺对Caki-2细胞增殖、生长的影响

Western blot结果表明，构建的SIRT4和SIRT4-H161Y（SIRT4功能突变体）载体能够过表达相应蛋白（图1A）。CCK-8检测结果表明，Gln剥夺48 h能够显著降低Caki-2细胞的增殖速度（P＜0.001）；正常Gln培养时，SIRT4过表达（overexpression，OE）能抑制细胞增殖（P＜0.05，图1B）。为进一步探索SIRT4抑制Gln在Caki-2细胞增殖中的作用，我们分析了SIRT4突变体H161Y以及回补Gln代谢产物α-KG后细胞增殖的变化，结果表明，在正常Gln培养时，过表达突变体不能抑制细胞增殖；另外，Gln剥夺组回补α-KG后，即使过表达SIRT4也不能抑制细胞增殖（图1C）。正常Gln培养时，SIRT4-OE能够减少细胞克隆数目，与对照组相比，差异有统计学意义（P＜0.05），而SIRT4-H161Y组却无明显差异。但如果长期缺乏Gln，Caki-2细胞无法生长，无克隆形成（图1D）。以上结果表明，SIRT4可通过抑制谷氨酰胺脱氢酶（glutamate dehydrogenase，GDH），减少Gln的摄入量，从而抑制Caki-2细胞增殖；在Gln剥夺后其细胞增殖抑制作用更为明显。

2.2 Gln代谢生成NADPH影响细胞内ROS

由于Gln代谢过程中会产生相当比例的NADPH，可作为抗氧化分子中和细胞内ROS，进而抵抗凋亡。因此NADPH含量检测显得尤为重要，检测结果表明，Gln剥夺48 h后NADPH生成量显著减少。另外，正常Gln培养的Caki-2细胞，SIRT4-OE组NADPH生成量比pCDH-con和SIRT-H161Y组减少（图2A）。氧化应激微环境是影响肿瘤生长、细胞凋亡的重要因素，为进一步探索SIRT4抑制Gln代谢对Caki-2细胞内ROS的影响，我们用DCFH-DA检测ROS水平，结果发现，正常Gln培养的Caki-2细胞中，SIRT4-OE组ROS水平较其他两组比明显升高；但细胞Gln剥夺后均会产生高水平的ROS，pCDH-con、SIRT4-OE和SIRT-H161Y这3组间差异无统计学意义（P＞0.05，图2B）。

图1 SIRT4过表达和Gln剥夺均能抑制细胞增殖Fig.1 SIRT4 overexpression and glutamine deprivation inhibit cell proliferation

图2 SIRT4-OE或Gln剥夺使得NADPH生成减少，ROS水平增高Fig.2 SIRT4-OE or glutamine deprivation reduces NADPH production and increases ROS levels

2.3 过表达SIRT4或Gln剥夺对Caki-2细胞凋亡的影响

线粒体膜电位的下降是细胞凋亡早期的一个标志性事件，非Gln剥夺的细胞，过表达SIRT4后，绿色荧光（JC-1）/红色荧光（JC-1 aggregates）比例升高，意味着线粒体膜电位下降。同时Gln剥夺后pCDH-con、SIRT4-OE、SIRT-H161Y此3组细胞的线粒体膜电位都有明显下降（图3A）。此外，凋亡检测结果表明，正常Gln培养时，pCDH-con、SIRT4-OE和SIRT4-H161Y细胞凋亡比例分别是2.777%、7.143%和2.363%，SIRT4过表达引起细胞凋亡增加（P＜0.05）；Gln剥夺引起各组细胞凋亡大幅度增加（图3B）。Bax、caspase-3、caspase-9均是凋亡相关蛋白，我们采用Western blot检测这些蛋白的表达变化来进一步探索SIRT4或Gln剥夺对凋亡的影响。结果显示，非Gln剥夺的Caki-2细胞，SIRT4过表达凋亡相关分子表达量都增加，同时Gln剥夺使得这些分子增加更为明显（图3C）。

图3 SIRT4-OE或Gln剥夺促进细胞凋亡Fig.3 SIRT4-OE or Gln deprivation promotes apoptosis

3 讨 论

ccRCC具有明显的代谢重编程特征，与葡萄糖、谷氨酰胺、脂肪酸等代谢途径发生改变有关。可利用改变的代谢途径作为潜在的治疗策略，SIRT4就是一个控制Gln代谢的重要分子。现有研究［8］表明，SIRT4作为一个抑癌基因参与肿瘤的发生、发展过程。在人类癌症和小鼠肿瘤模型中，SIRT4可以通过影响Gln代谢发挥其抑制肿瘤的作用［9-10］，目前尚无SIRT4在ccRCC中作用的研究。本研究发现，Gln剥夺对ccRCC细胞Caki-2的增殖、凋亡影响最为明显。然而，谷氨酰胺被众多细胞途径所利用，包括核苷酸的产生［14］，DNA［15］和RNA［16］的合成，虽然肿瘤细胞对Gln十分依赖，存在“谷氨酰胺成瘾”现象，同时除了葡萄糖以外，Gln也是哺乳动物细胞用于生长和增殖的主要元素之一，对正常细胞同样是必不可少的，因此彻底剥夺Gln是对肿瘤细胞最有效却并非是一个最好的治疗方法。如果能够增加SIRT4在ccRCC肿瘤组织中的表达量（如SIRT4激活剂）就能减少肿瘤细胞Gln的利用，发挥抑制肿瘤生长、促进凋亡的作用。除此之外，抑制Gln代谢减少NADPH生成使得ROS显著升高，肿瘤细胞比正常细胞对高浓度的ROS更敏感，会因细胞结构不稳定等原因导致肿瘤细胞走向凋亡坏死。综上所述，SIRT4对ccRCC而言是一个有利分子，或将成为阻止肿瘤摄取Gln潜在的治疗靶向分子。