山芝麻中β-谷甾醇的定性和定量分析

陈 贵 夏稷子 徐作刚

黔南州检验检测院，贵州 都匀 558000

山芝麻为梧桐科植物山芝麻HelicteresangustifoliaL.的干燥根，具有解表清热、解毒消肿的功效，用于感冒高热、扁桃体炎、咽喉炎、腮腺炎、皮肤湿疹、痈肿等[1-2]。现代药理研究[3-4]表明，山芝麻具有抗病毒、抗炎、镇痛、抗肿瘤等作用。β-谷甾醇是山芝麻中的一种甾醇类物质，具有降血脂、抗炎、抗肿瘤、抗氧化等作用[5-6]。目前还未见山芝麻中β-谷甾醇含量测定的相关报道。本实验通过TLC法对山芝麻中的β-谷甾醇进行定性鉴别，并采用HPLC法对其含量进行测定，为山芝麻的质量控制提供了参考。

1 仪器与材料

LC-2010A型高效液相色谱仪(日本岛津公司)；AG135型十万分之一电子天平、AL204型万分之一电子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；DK-98-ⅡA型电热恒温水浴锅(天津泰斯特公司)；SK250LHC型超声波清洗仪(上海科导公司)。山芝麻对照药材(批号：121088-201103)，β-谷甾醇对照品(批号：110851-201909，含量以92.7%计)，购于中国食品药品检定研究院； G型硅胶板(批号：20180619)，青岛海洋化工有限公司生产；甲醇为色谱纯；其余试剂为分析纯。山芝麻药材(批号：20190401、20190501、20190901)购于药材市场，经黔南州检验检测院夏稷子主任药师鉴定为梧桐科山芝麻HelicteresangustifoliaL.的干燥根。

2 方法与结果

2.1 TLC鉴别[7-9]

2.1.1 供试品溶液制备 取山芝麻粉末2.5 g，加30 mL三氯甲烷超声处理30 min，过滤后的滤液置水浴上蒸干，残渣用2 mL三氯甲烷使其溶解，即得。

2.1.2 对照药材溶液制备 取山芝麻对照药材2.5 g，同“2.1.1”项下方法制备对照药材溶液。

2.1.3 对照品溶液制备 取β-谷甾醇对照品适量，加三氯甲烷制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作为对照品溶液。

2.1.4 鉴别 按《中华人民共和国药典》2015年版四部通则0502薄层色谱法试验，吸取以上三种溶液各2 μL，分别点于同一G型硅胶薄层板上，置展开剂为石油醚(60～90 ℃)-乙酸乙酯(5∶1)的展开缸内展开，取出后晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液并在105 ℃加热至斑点显色清晰，日光下检视，供试品色谱在与山芝麻对照药材色谱和β-谷甾醇对照品色谱对应的位置上，显相同的紫红色斑点，TLC色谱图见图1。

2.2 HPLC含量测定

2.2.2 对照品储备液的制备 取β-谷甾醇对照品，加入甲醇制成每1 mL含184.7 μg的溶液，即得。

2.2.3 供试品溶液的制备 取山芝麻粉末(过三号筛)约2 g，精密称定，精密加入甲醇25 mL，称定重量后加热回流30 min，放冷，加甲醇补足减失的重量，摇匀，用微孔滤膜滤过，即得。

2.2.4 线性关系考察 分别精密吸取“2.2.2”项下的对照品储备液1 mL置于2 mL、5 mL、10 mL、25 mL、50 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，得系列浓度对照品溶液。取“2.2.2”项下对照品储备液及上述5个稀释浓度的溶液测定峰面积。以β-谷甾醇对照品质量浓度(X)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标进行线性回归，绘制工作曲线，得回归方程Y=2676.7X+2649.8(r=0.9999)，线性范围为3.694～184.7 μg/mL，标准曲线图见图3。

2.2.5 精密度试验 取“2.2.4”项下稀释至10 mL的对照品溶液，照“2.2.1”项下的条件重复进样6次，记录β-谷甾醇的峰面积，结果RSD为0.65%。表明仪器的精密度良好。

2.2.6 稳定性试验 取山芝麻样品(批号：20190501)，照“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，分别于制备后0、2、4、6、8和12 h照“2.2.1”项下条件测定β-谷甾醇的含量。结果其含量的RSD为2.73%。表明供试品溶液在制备后12 h内稳定。

2.2.7 重复性试验 取山芝麻样品(批号：20190501)，照“2.2.3”项下的方法制备6份供试品溶液，照“2.2.1”项下的条件测定。结果测得6份供试品中β-谷甾醇含量的平均值为0.188 mg/g，RSD为1.84%。表明该方法具有良好的重复性。

2.2.8 加样回收率 取β-谷甾醇对照品，加甲醇制成每1 mL含18.47 μg的加样回收用储备液。取山芝麻样品(批号：20190501)粉末(过三号筛)约1 g，精密称定，精密加入上述加样回收用储备液10 mL，再精密加入甲醇15 mL，称定重量后加热回流30 min，放冷，加甲醇补足减失的重量，摇匀，用微孔滤膜滤过，制得加样回收供试品溶液，照“2.2.1”项下的条件进行测定，计算β-谷甾醇的加样回收率。结果见表1。

表1 加样回收率测试结果 (n=6)

2.2.9 样品测定 分别取批号为20190401、20190501和20190901的山芝麻样品，各批次均照“2.2.3”项下方法平行制备3份供试品溶液，照“2.2.1”项下条件，外标法测定β-谷甾醇的含量，结果见表2。

表2 不同批次样品中β-谷甾醇的含量测定结果 (n=3)

3 讨论

3.1 TLC展开剂比例的选择 实验考察了石油醚(60～90 ℃)-乙酸乙酯不同比例(5∶1、7∶1和9∶1)的影响，结果三种展开剂比例下β-谷甾醇的Rf值分别为0.43、0.30和0.24，当展开剂比例为5∶1时，β-谷甾醇Rf值适中，且与相邻斑点有更好的分离度，故选择展开剂比例为5∶1。

3.2 HPLC检测波长的选择 实验在200～400 nm波长范围内对β-谷甾醇进行了光谱扫描，结果在此范围内β-谷甾醇均无最大吸收，在低波长下有较大吸收。实验比较了检测波长(205、208和210 nm)的影响，结果在210 nm下基线较其他两个波长更平稳，因此实验选择210 nm作为HPLC检测波长。

3.3 HPLC提取条件的选择 实验考察了提取方式、提取时间对样品中β-谷甾醇提取的影响。在提取时间均为30 min的情况下，超声提取所得β-谷甾醇含量为加热回流提取的84.7%；采用加热回流提取，不同提取时间(15、30和45 min)所得β-谷甾醇的含量分别为0.178、0.184和0.185 mg/g。因此，实验选择加热回流提取30 min作为β-谷甾醇HPLC测定的提取条件。

本实验建立的TLC方法在3批次山芝麻样品中重复性好，所得β-谷甾醇斑点清晰，且与相邻斑点分离度良好；采用HPLC法测定β-谷甾醇的含量，方法操作简单，结果准确可靠，可应用于山芝麻的质量控制。