急性脑梗死病人发病后脾脏体积变化及与血清炎性因子、T淋巴细胞的相关性分析

潘晶晶

目前急性脑梗死已成为我国致残、致死的主要疾病之一，急性脑梗死的发生激活颅内免疫应答，引起大量炎性因子释放，破坏血管内皮细胞连接紧密性，增加血脑屏障通透性[1-4]。一些淋巴细胞、炎性因子等通过受损血脑屏障进入脑实质，从而进一步加重脑损伤。脾脏作为外周免疫器官，在生理或病理应激刺激下，将免疫细胞、血小板等释放至血液循环系统中，因其释放的血小板体积大、活性强，引起血小板反应，严重影响缺血性脑血管疾病病人预后[5-6]。有文献报道，血小板高反应性(high on treatment platelet reactivity，HPR)卒中病人预后较差，且多出现复发[7-8]。动物实验研究发现，出现脑缺血后，脾脏大量释放免疫细胞和炎性因子进入体液循环中，自身体积出现缩小[9]。有文献报道，脾脏切除将大大降低体液循环中淋巴细胞和炎性因子数量，从而阻止T淋巴细胞信号因子传递，进而发挥脑保护作用[10]。本研究观察急性脑梗死发生后脾脏体积变化特点，并探讨其与炎性因子、T淋巴细胞的关系，以期为急性脑梗死在免疫学上的治疗提供科学依据。

1 资料与方法

1.1 资料收集 选取2016年1月—2018年1月发病24 h内入住我院的急性脑梗死病人作为研究对象。纳入标准：经头颅CT/MRI检查符合《中国急性缺血性脑卒中诊治指南2014》[11]中的急性脑梗死诊断标准；发病24 h内入院就诊，且美国国立卫生研究院卒中量表(NIHSS)评分>5分[12]；年龄≥18岁；根据急性脑卒中TOAST分型明确为动脉粥样硬化型脑梗死、心源型脑梗死或小动脉闭塞型脑梗死；入院前服用阿司匹林7 d以上。排除标准：伴有癫痫或急性心肌梗死病人；伴有肿瘤、自身免疫疾病或血液疾病病人；长期服用免疫抑制剂病人；伴有泌尿系统、肺部感染病人；伴有心、肺、腹部严重疾病，不能配合完成各项检查病人。最终纳入符合纳入和排除标准病人63例，其中陈旧性脑梗死13例；陈旧性心肌梗死13例；入院时NIHSS评分(9.07±3.25)分；入院后NIHSS评分(7.09±3.18)分；梗死部位：大脑半球25例，后循环19例，基底节14例；梗死类型：大动脉粥样硬化36例，心源性脑梗死10例，穿支动脉17例。选择同期与急性脑梗死病人基本资料匹配的非急性脑梗死病人30例作为对照组，年龄≥18岁，入院前服用阿司匹林7 d以上，伴有至少两项脑血管疾病危险因素，如：高血压、糖尿病、吸烟和饮酒等。排除标准同急性脑梗死组。所有入选病人均签署知情同意书，且本研究经医院伦理委员会同意。

1.2 方法

1.2.1 资料收集 收集病人基本资料(姓名、性别、年龄、身高、体重)、既往病史(高血压、糖尿病、心脏疾病、卒中病史、高脂血症等)、药物使用情况、个人嗜好(吸烟、饮酒)、家族史、实验室检查(血常规、血糖、血脂、肝肾功能、凝血)、影像学资料(头颅CT/MRI、头颈血管彩色超声/磁共振血管造影)。

1.2.2 脾脏体积测量 急性脑梗死病人入院时，发病36 h、3 d和5 d，参照文献[13]方法使用彩超测量脾脏体积，即病人平卧休息10 min，之后取右侧卧位，探头平行肋间隙，二维声像图上清晰显示脾脏体积调整至脾门切面(厚度最大切面)，测量脾脏长径(a)和厚径(b)，之后转动探头垂直于肋间隙测量宽径(c)，脾脏体积(V)=a×b×c×π/6。彩超型号：Philips iu-22，探头设置为“Abdomen”，频率为2～5 MHz。同时测量对照组脾脏体积确定脾脏基线，本研究彩超测量均由同一位医师完成。

1.2.3 血清炎性因子血清干扰素-γ检测 采用酶联免疫试剂盒(ELSIA)检测血清干扰素-γ，严格按照试剂盒说明书进行检测，试剂盒购自赛默飞生物有限公司。

1.2.4 T淋巴细胞检测 采集肘静脉血3 mL，充分摇匀，采用流式细胞仪检测T淋巴细胞，即取100 μL抗凝血加入至上样管中，充分混匀，之后分别加入荧光素标记的抗体20 μL(异硫氰酸荧光素标记的抗CD4单克隆抗体、藻红蛋白标记的抗CD8单克隆抗体、叶绿素蛋白标记的抗CD19单克隆抗体、藻红蛋白标记的CD56单克隆抗体)，同时进行阴性对照，涡旋混匀，避光室温孕育20 min，之后分别加入2 mL经10倍稀释的破红细胞低渗液，涡旋混匀，避光室温孕育10 min，之后离心弃上清液，磷酸缓冲盐溶液(PBS)清洗3次，最后悬浮于5 mL的PBS中，采用流式细胞仪检测CD4T、CD8T、CD19B、CD6自然杀伤淋巴细胞百分比，计算相应绝对值。

1.2.5 血小板反应性检测 采用PL-12血小板功能分析仪检测血小板最大聚集率(AA-MAR)。细胞检测同时，抽取肘静脉血6 mL，注入660 μL、3.8%的枸橼酸钠专用管中摇匀，取0.3 mL至PL-12检测管中自动检测。获得基础数值后，加入25 μL的诱聚剂AA，连续间隔2 min得到标本中血小板计数，得到最低血小板计数时结果自动换算。最大血小板聚集率(%)=(基础血小板数平均值-最低血小板数)/基础血小板数平均值×100%。

2 结 果

2.1 两组临床资料比较(见表1)

表1 两组临床资料比较

2.2 对照组和急性脑梗死组不同时间脾脏体积和淋巴细胞变化 急性脑梗死病人脾脏体积先缩小后增大。与对照组比较，急性脑梗死病人发病24h内和36 h脾脏体积缩小，且36 h脾脏体积小于24 h脾脏体积，差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组比较，发病3d和5d脾脏体积增大，且5d脾脏体积大于3 d脾脏体积，差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组比较，急性脑梗死病人发病24h内、36h、3d和5 d时T4淋巴细胞、B淋巴细胞和自然杀伤淋巴细胞水平升高，差异有统计学意义(P<0.05)；其中发病36 h三种淋巴细胞水平高于发病24 h内，而发病36 h后随着时间延长，三种淋巴细胞水平不断升高，差异无统计学意义(P>0.05)。T8淋巴细胞不同时间呈升高趋势，差异无统计学意义(P>0.05)。详见表2。

表2 对照组和急性脑梗死组不同时间脾脏体积、淋巴细胞变化(±s)

2.3 对照组和急性脑梗死组不同时间AA-MAR和血清干扰素-γ变化 急性脑梗死病人发病24 h内、36 h、3 d和5 d AA-MAR和血清干扰素-γ于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，发病36 h AA-MAR和血清干扰素-γ水平高于发病24h内，差异有统计学意义(P<0.05)。发病3 d AA-MAR和血清干扰素-γ水平出现下降，与发病36h比较差异无统计学意义(P>0.05)；发病5 d AA-MAR和血清干扰素-γ水平低于发病3d，差异有统计学意义(P<0.05)。详见表3。

表3 对照组和急性脑梗死组不同时间AA-MAR和血清干扰素-γ变化(±s)

2.4 急性脑梗死病人不同时间脾脏体积与淋巴细胞水平、血小板反应性、炎性因子的相关性分析 急性脑梗死病人发病24 h内和发病36 h，T4淋巴细胞、B淋巴细胞和自然杀伤淋巴细胞与脾脏体积呈负相关，发病3 d和5 d未发现相关性。不同时间T8淋巴细胞和脾脏体积无相关性。发病24h内、36h和3d时，AA-MAR、干扰素-γ与脾脏体积均呈负相关，而发病5 d均未发现相关性。详见表4。

表4 急性脑梗死病人不同时间脾脏体积与淋巴细胞水平、血小板反应性、炎性因子的相关性分析

3 讨 论

动物和临床试验均已证明免疫炎症反应加重缺血性脑损伤，但其具体作用机制未见明确报道。本研究发现急性脑梗死急性期脾脏体积先缩小后变大，淋巴细胞发生相应变化，与已有文献报道[13]结果一致。本研究还发现急性脑梗死急性期AA-MAR发生相应变化，提示急性脑梗死发病后脾脏通过释放血小板、炎性因子及淋巴细胞等加重病人病情。

国外学者通过构建脑卒中动物模型，结果发现脑卒中后脾脏体积出现明显缩小，重量减轻，且在发病2 d时达到最小，随后开始变大，发病4 d时恢复正常[9]。本研究选取发病24 h内、36 h、3 d和5 d 4个时间对急性脑梗死病人脾脏体积进行测量，结果显示发病24 h内，病人脾脏体积和对照组比较出现缩小，发病36 h脾脏体积最小，发病3 d时脾脏体积大于对照组，发病5 d时脾脏体积最大，与上述研究结果一致。Seifert等[9]采用大脑动脉闭塞构建卒中模型，并采用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记脾脏细胞，发现脾脏体积减小，循环中被标记的脾脏细胞增多，推测可能与脾脏体积减小有关。有学者认为，脾脏体积缩小与交感神经系统激活有关，因脾被膜的α1肾上腺素激活后，刺激脾被膜平滑肌收缩，从而引起脾脏体积减小[15]。

本研究发现急性脑梗死发生后4个时间干扰素-γ呈先升高后降低趋势。动物实验研究发现，通过大脑动脉闭塞构建卒中模型后，循环中干扰素-γ先升高后恢复正常，但与本研究达到峰值时间不同，可能与大脑动脉闭塞构建卒中时间有关[13-14]。本研究通过相关性分析结果发现，干扰素-γ与脾脏体积呈负相关，且随着脾脏体积波动而变化。有研究发现，脾脏切除大脑动脉闭塞构建卒中模型脑梗死病灶内干扰素-γ水平低于未切除脾脏卒中模型，脑梗死病灶体积更大，注射重组干扰素-γ后，梗死体积明显增大，提示干扰素-γ抵抗脾脏切除的神经保护作用[16]。结合本研究结果认为，脾脏可能通过产生或释放干扰素-γ等炎性因子参与脑卒中损伤，其具体作用机制需进一步探讨。

有文献报道，脑缺血后机体固有免疫吸引大量淋巴细胞进入颅内，促进炎性反应，直接损伤神经细胞，进而加重卒中损伤[17]。本研究发现在急性脑梗死发生后T4淋巴细胞、B淋巴细胞和自然杀伤淋巴细胞增多，且在发病36 h与脾脏体积呈负相关，而不同时间T8细胞与脾脏体积未见相关性。脾脏作为重要的免疫器官，含有大量淋巴细胞，在循环中被抗原激活离开脾脏。有研究发现，脑卒中发生后外周血淋巴细胞明显增加，其与脾脏体积呈负相关，但未进行淋巴亚群分析[18]。Seifert等[9]采用CFSE标记脾脏细胞发现被释放进循环，进入病灶，这些细胞最终证实为自然杀伤细胞、T淋巴细胞和单个核细胞。本研究证实淋巴细胞与脾脏体积相关，进一步验证脾脏通过释放淋巴细胞参与急性脑梗死损伤的推论，并明确参与损伤的细胞主要为T淋巴细胞、B淋巴细胞和自然杀伤淋巴细胞。

本研究结果发现，脑卒中后血小板AA-MAR增强，且其变化与脾脏体积存在相关性。有文献报道，抗栓治疗后HPR是卒中病人预后和复发的独立危险因素[7]。临床中多采用血小板聚集率反映血小板反应，血小板平均体积越大，其反应性越高。有学者发现，脾脏内血小板体积大于循环中血小板，而心肌梗死后循环中血小板体积进一步增大，血小板反应性增高，当脾脏切除后，抵抗血小板反应性[6]。目前脾脏释放血小板和血小板被激活的作用机制未有明确报道，有学者认为其可能与儿茶酚胺升高有关[19]。因此，关注缺血诱导的脾脏释放体积较大的高反应性血小板，是治疗急性脑梗死的重要途径之一。

目前临床已证实在溶栓时间窗内联合应用芬戈莫德和阿替普酶可明显减小脑梗死面积，改善病人预后，且未增加不良反应发生[20]。有文献报道，发病4.5 h后给予芬戈莫德，主要抑制淋巴细胞释放，减轻脑损伤程度，促进病情恢复[21]。有学者构建动物卒中模型后注射多能成体祖细胞，抑制脾脏释放淋巴细胞，从而减轻免疫损伤，改善预后[22]。脾脏参与急性脑梗死免疫应答的部分机制，血小板、淋巴细胞及炎性因子均有可能成为急性脑梗死治疗的新靶点。