五味子乙素对心肌缺血再灌注心肌细胞及线粒体损伤的影响

武卫党，张丹凤，郭纪文，徐晓辉，路 艳，陈文璐，耿蓬勃

心肌缺血/再灌注造成的损伤是目前临床限制冠状动脉介入治疗、冠状动脉搭桥和冠状动脉溶栓等治疗手段有效开展的关键问题，且可能导致心肌缺血/再灌注性二次损伤，严重限制上述手术治疗手段的广泛运用，给病人健康带来了极大风险[1]。五味子乙素是在中药北五味子中含量最高的联苯环辛烯类木脂素。北五味子属于收敛固涩药，具有益气生津、宁心安神功效，使其广泛存在于补益类的方剂之中，同时具有辛、甘、酸、苦、咸五种药性，酸、咸入肝而补肾，辛、苦入心而补肺，甘入中宫益脾胃，常用于治疗肝脏疾病。有研究发现，北五味子乙素对大鼠心肌缺血再灌注损伤有一定的保护作用，其机制可能与减少氧自由基释放、保护缺血心肌免受缺血再灌注损伤有关，北五味子乙素对大鼠离体心肌缺血再灌注损伤具有保护作用，通过诱导自噬改善缺血再灌注损伤发生[2-4]。内质网是细胞蛋白合成的主要场所，在缺氧、氧化应激等情况下，内质网未折叠的蛋白质明显增多，当超过内质网处理能力，细胞激活相关信号级联反应，恢复内质网蛋白质折叠环境，但持续的内质网应激发生可诱导下游分子激活，直接诱导细胞凋亡发生，也导致线粒体氧化应激反应，影响线粒体功能。线粒体是细胞能量发生器，线粒体功能异常进一步促进细胞凋亡的发生[5-6]。本研究将通过建立大鼠心肌细胞缺氧/复氧模型及内质网激动剂诱发的大鼠心肌细胞内质网应激模型，探讨五味子乙素对心肌细胞缺血再灌注及内质网应激导致线粒体损伤的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料及主要仪器 五味子乙素、毒胡萝卜素内脂购自Sigma公司。H9c2大鼠心肌细胞株购自中国科学院上海细胞库；改良Eagle培养基(DMEM)、胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)购自GIBCO公司；ATP检测试剂盒、线粒体提取试剂盒均购自江苏碧云天生物技术研究所；超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-px)、丙二醛(MDA)，线粒体呼吸链复合酶试剂盒(南京建成生物工程公司)；细胞色素C、Caspase 3、Caspase 9酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒(Santa，美国)。主要仪器Heracell 240i型二氧化碳培养箱(Thermofisher公司，美国)；BCM-1000生物洁净工作台(青岛聚创美家环保技术有限公司)；酶标仪(Tecan公司，瑞士)。

1.2 H9c2大鼠心肌细胞株培养 H9c2大鼠心肌细胞株培养在含10%新生牛血清的DMEM培养基中，于37 ℃、5%的CO2细胞培养箱中孵育。取对数生长期细胞，D-hanks液漂洗后加入含1%新生牛血清的DMEM培养基。不做缺氧/复氧处理，即为正常组。

1.3 H9c2缺氧/复氧模型及毒胡萝卜素内脂诱导内质网应激模型建立

1.3.1 缺氧/复氧模型 将H9c2心肌细胞置于37 ℃、95%N2、5%CO2恒温培养箱中培养，10%FBS的DMEM培养液更换为磷酸缓冲盐溶液(PBS)缓冲液，在缺氧复氧培养箱充入95%N210 min后，将缺氧复氧培养箱放入37 ℃的恒温培养箱中进行缺氧4 h，之后去掉PBS缓冲液，重新加入10%FBS的DMEM培养基，放置于37 ℃，20%O2，5%CO2中培养12 h后检测各项指标即为模型组。五味子乙素干预组分别于缺氧4 h模型建立后，给予五味子乙素低剂量、中剂量、高剂量(5 μmol/L、25 μmol/L、125 μmol/L)干预12 h检测各项指标。

1.3.2 毒胡萝卜素内脂诱导内质网应激模型 将H9c2心肌细胞置于37 ℃，5%CO2恒温培养箱中培养后，10%FBS的DMEM培养液培养，加入40 nmol/L毒胡萝卜素内脂24 h，检测各项指标。五味子乙素干预组分别于毒胡萝卜素内脂加入后，给予五味子乙素低剂量、中剂量、高剂量(5 μmol/L、25 μmol/L、125 μmol/L)干预24 h检测各项指标。

1.4 四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色(MTT)法检测H9c2细胞存活率 将H9c2心肌细胞以1×104个/孔接种于96孔板中，细胞贴壁后，缺氧细胞4 h后分别加入不同浓度五味子乙素(分别为20 μmol/L、40 μmol/L、60 μmol/L)，每孔200 μL，每个浓度设5个复孔，培养12 h后，用于MTT检测；H9c2心肌细胞以1×104个/孔接种于96孔板中，分别加入不同浓度五味子乙素(分别为20 μmol/L、40 μmol/L、60 μmol/L)及30 nmol/L毒胡萝卜素内脂24 h后，用于MTT检测。检测细胞每孔中加入5 g/L的MTT 20 μL继续培养4 h，弃去上清液，向每孔中加入二甲基亚砜(DMSO)100 μL溶解结晶体，置于摇床振荡10 min，至蓝紫色颗粒完全溶解后，于酶标仪570 nm波长处测定每孔吸光度值(A)，实验重复3次。

1.5 心肌细胞SOD、GSH-Px活性、MDA含量检测 采用南京建成生物医学工程研究所购买的SOD、GSH-Px、MDA试剂盒，检测两种模型心肌细胞SOD、GSH-Px活性、MDA含量。

1.6 分离提取线粒体、细胞质 按照试剂盒方法，用细胞刮收集5×107个细胞，预冷PBS冲洗，4 ℃条件下，600 r/min离心5 min；弃上清液，加入1 mL线粒体提取液，并加入蛋白酶抑制剂，置于冰上孵育10 min；转移细胞悬液至预冷的Dounce匀浆器中，研磨。4 ℃条件下离心10 min；取上清液，4 ℃条件下，17 000 r/min离心20 min；收集上清液的细胞质部分，将沉淀保存于线粒体储存液中；BCA蛋白定量，样品于-20 ℃保存。

1.7 观察指标

1.7.1 检测心肌细胞ATP含量 将处于对数生长期的H9c2心肌细胞接种于12孔板中，每孔5×105个细胞，1 mL培养液，培养12 h，待细胞覆盖板底70%后建模加药处理。设置药物浓度为20μmol/L、40 μmol/L、60 μmol/L，另设对照组。收集细胞于离心管中，10 000 r/min离心5 min，弃上清液，每管加入100 μL裂解液。待细胞充分裂解后，4 ℃条件下，12 000 r/min离心10 min，取上清液用于后续测定。取新96孔板，每孔加入100 μL ATP工作液(1∶100)，室温下放置5 min。待底物ATP消耗完毕，避光条件下每孔加入30 μL BCA法蛋白定量后样品，2 s后立即检测。以上实验步骤重复3次。

1.7.2 线粒体复合物Ⅲ、Ⅳ活性检测 采用紫外分光光度法测定线粒体复合物活性，操作步骤按线粒体复合物定量检测试剂盒产品说明书进行。

1.7.3 心脏细胞谷氨酸脱氢酶、细胞色素C、Caspase 3、Caspase 9检测 按照谷氨酸脱氢酶、细胞色素C、Caspase 3、Caspase 9检测试剂盒方法进行，所有检测指标均进行标准曲线建立，样品吸光度值(A)根据标准曲线计算浓度。

2 结 果

2.1 五味子乙素对H9c2模型细胞活力的影响 细胞活力实验结果表明，缺氧复氧模型心肌细胞相对于正常细胞，其细胞活力显著降低，五味子乙素可明显增加心肌细胞活力，具有明显的浓度依赖性。内质网模型细胞活力显著降低，给予五味子乙素可显著升高细胞活力并具有浓度依赖性。详见图1。

与模型组比较，*P<0.05。

2.2 五味子乙素对心肌细胞SOD、GSH-Px、MDA水平的影响 与正常组比较，缺氧/复氧模型及毒胡萝卜内脂诱导大鼠心肌细胞抗氧化酶SOD、GSH-Px活性均降低，MDA显著升高，差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。五味子乙素具有显著抑制氧化应激反应作用，显著升高SOD、GSH-Px活性，并降低MDA含量，在缺氧/复氧模型五味子乙素均具有该作用。详见表1。

表1 五味子乙素对心肌细胞SOD、GSH-Px、MDA水平的影响(±s)

2.3 五味子乙素对线粒体复合物Ⅲ、Ⅳ活性的影响 与正常组比较，缺氧/复氧及内质网应激细胞两种模型心肌细胞线粒体复合物Ⅲ、Ⅳ活性较正常细胞均显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)。给予五味子乙素后可明显提高线粒体复合物Ⅲ、Ⅳ活性，其中五味子乙素中剂量组、高剂量组与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05)。详见表2。

表2 五味子乙素对线粒体复合物Ⅲ、Ⅳ活性的影响(±s) 单位：mmol/(min·mg)

2.4 五味子乙素对心肌细胞中ATP含量的影响 两种模型细胞线粒体能量供应降低，ATP含量降低。通过检测细胞ATP含量显示，两种模型心肌组织ATP含量均显著降低(P<0.01)，给予五味子乙素后两种模型细胞ATP含量显著提高(P<0.05)。详见表3。

表3 五味子乙素对不同模型细胞ATP含量的影响(±s) 单位：μmol/mg

2.5 五味子乙素对细胞色素C、Caspase 3、Caspase 9水平的影响 两种模型组相较于正常组，细胞色素C、Caspase 3、Caspase 9均显著升高，说明线粒体损伤发生导致细胞色素C释放，同时激活Caspase 3、Caspase 9；给予五味子乙素后，随着给药剂量增加，五味子乙素可有效降低模型心肌细胞中细胞色素C、Caspase 3、Caspase 9水平，差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。详见表4。

表4 五味子乙素对细胞色素C、Caspase 3、Caspase 9水平的影响(±s)

3 讨 论

心肌缺血后再灌注损伤指冠状动脉部分或完全急性阻塞后，一定时间内又重新获得再通，缺血心肌虽然恢复正常灌注，但其组织损伤反而呈进行性加重的病理过程。缺血期引起心肌超微结构、能量代谢、心功能和电生理等一系列变化，血管再通后表现突出，甚至发生严重心律失常导致猝死[6]。缺血再灌注损伤发生机制尚未完全明确，自由基、钙超载、心肌纤维能量代谢障碍、中性粒细胞、血管内皮细胞、细胞黏附分子与细胞凋亡等均可能参与缺血再灌注损伤。

目前研究发现内质网应激是导致心肌缺血再灌注损伤的主要诱因之一[7]。内质网是细胞加工蛋白质和贮存Ca2+的主要场所，对维持细胞存活和发挥细胞的正常生理功能具有重要作用。内质网对应激敏感，细胞内外环境应激因子如缺氧、缺糖、ATP耗竭、钙超载及蛋白降解减弱等刺激下，均引起内质网稳态失衡，使未折叠蛋白或错误折叠蛋白在内质网积聚，统称为内质网应激。内质网应激是机体重要的自我保护机制，但应激反应过强或应激反应时间过长，引起细胞凋亡并导致组织损伤，缺血再灌注损伤时，大量自由基生成引起氧化应激反应等，诱导内质网过度应激，导致心肌组织损伤[8-10]。内质网应激导致应激活化蛋白激酶(JNK)激活，而JNK途径是调控线粒体功能的关键信号途径，其激活引起线粒体外膜通透性转变孔开放，导致线粒体膜电位降低，线粒体应激反应和线粒体膜通透性增加[11]，引起线粒体内细胞色素C、Caspase 3、Caspase 9等细胞因子释放，诱导细胞凋亡发生[12-13]，导致线粒体呼吸链正常活动抑制，呼吸链复合物活性改变，线粒体ATP产生明显减少，影响线粒体能量生成[14-15]，最终诱导细胞凋亡发生[16]。

本研究建立缺氧/复氧H9c2心肌损伤模型及毒萝卜素内脂诱导的H9c2内质心肌细胞内质网应激损伤细胞模型，通过检测两种模型五味子乙素对细胞氧化应激反应的干预作用，结果表明五味子乙素可有效改善两种模型细胞氧化应激状态，升高SOD、GSH-Px抗氧化酶活性，降低细胞MDA含量，改善脂质过氧化状态；通过检测心肌组织谷氨酸脱氢酶和细胞色素C、Caspase 3、Caspase 9，结果发现五味子乙素可同时减少心肌细胞谷氨酸脱氢酶和细胞色素C及Caspase 3、Caspase 9水平，对线粒体膜完整性具有明显的保护作用。通过检测心肌细胞ATP水平及呼吸链复合酶，结果表明五味子乙素线粒体能量供应具有明显恢复作用，可有效提高两种模型细胞ATP含量，恢复部分线粒体复合酶活性。

综上所述，五味子乙素对心脏缺血再灌注损伤和线粒体功能具有明显的保护作用。