基于果实苦涩味新疆核桃资源遗传多样性分析

俞文君,金 强,李 根,张 锐,吴翠云,王新建,于 军

(塔里木大学植物科学学院,南疆特色果树高效优质栽培与深加工技术国家地方联合工程实验室,新疆生产建设兵团塔里木盆地生物资源保护利用兵团重点实验室,新疆阿拉尔 843300)

核桃(JuglansregiaL.)别名胡桃,为胡桃科胡桃属乔木,温带树种,位列世界四大干果之首,素有“木本油料之王”的称号[1]。新疆产区核桃种质资源十分丰富,存在大量野生种及栽培种,且栽培地域十分广泛[2],主要分布在塔里木盆地周边绿洲,如和田、阿克苏、喀什等地,产量居全国前列。在东疆吐鄯托盆地以及北疆伊犁等地,野生核桃资源也闻名于世[3]。新疆野核桃属于国家二级保护植物,经长期自然杂交、实生繁殖,形成了后代遗传变异程度高、品质独特、坚果类型丰富的野生核桃种质资源库[4]。

核桃果实除含有丰富油脂外,还有酚类化合物、多种维生素及矿质元素等。核桃仁外层,呈深浅不一淡黄色、黄色或褐色薄皮,称为核桃内种皮[5],核桃内种皮含有大量酚类物质[6-7],尤其是含有能沉淀蛋白质、生物碱的水溶性单宁成分[8]。当单宁与口腔中唾液蛋白结合会产生收敛性,即苦涩味,从而影响口感[9],进而影响消费者对核桃的食用量或青睐程度。

目前关于核桃多酚含量及提取方法的研究已引起相关学者关注,针对新疆核桃营养成分的研究也有相关报道,研究表明多酚和单宁与苦涩味有直接关系,目前关于干果苦涩品质的研究报道还相对较少[10-14]。本文主要通过评价部分新疆核桃种质果实苦涩味的相关品质,旨在发掘部分酚类物质含量呈现极差的核桃种质材料,筛选低苦涩味核桃种质材料,为今后新疆核桃果实综合品质遗传改良准备中间材料。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

核桃种质材料 塔里木大学园艺试验站、温宿县核桃种质资源圃、温宿县木本粮油林场、叶城县三个乡镇(加依提勒克乡布力米吾斯塘村、江格勒斯乡代尔瓦扎库木村、依提木孔乡亚勒古孜巴格村),2018年9月2日至9月10日,在树的树冠中部外围,采集发育正常的完熟期果实30个,详细情况见表 1;正己烷、甲醇、磷酸 分析纯,天津市致远化学试剂有限公司;盐酸 分析纯,四川西陇化工有限公司;硫酸锂、钨酸钠、钼酸钠 分析纯,天津市光复精细化工研究所;溴水 分析纯,天津市大茂化学试剂厂;无水碳酸钠 分析纯,天津永晟精细化工有限公司;没食子酸 分析纯,天津市鼎盛鑫化工有限公司。

表1 供试核桃材料的编号、名称及采样地点Table 1 Number,name and sampling sites of the tested walnut material

TU-1800型紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司;X500R UPLC-Q-TOF液质联用仪 美国AB公司;ODS3 C18(2.1 mm×50 mm)色谱柱 日本岛津公司。

1.2 实验方法

1.2.1 外观指标测定 主要包括核桃果实单果重、纵径、横径、侧径、果形指数、出仁率、壳厚度、缝合线高度,测定方法参考《农作物种质资源鉴定评价技术规范核桃》[15]。果形指数=果实纵径/[(果实横径+果实侧径)/2],出仁率=果仁重/单果重×100。

1.2.2 苦涩味指标测定

1.2.2.1 儿茶素、芦丁、香草酸、槲皮素、绿原酸、没食子酸含量测定 核桃肉磨粉,准确称取1.0000 g置于 15 mL 离心管中,先加入3 mL正己烷,充分振荡1 min,10000 r/min离心,去掉上清(除去油脂),控干;之后加入4.0 mL 80%甲醇水溶液,常温下浸泡2 h,然后超声提取30 min 后,10000 r/min离心收集上层提取液,再加入4.0 mL 80%甲醇水溶液进行超声提取,离心收集合并提取液,以 80%甲醇定容至 10 mL,得供试品溶液;经0.2 μm微孔滤膜过滤,备用。

采用液质联用法(AB X500R UPLC-Q-TOF),色谱柱为岛津ODS3 C18(2.1 mm×50 mm),流动相A为0.25%甲酸水,流动相B为0.25%甲酸乙腈溶液,流速为0.3 mL/min,进样量为10 μL,柱温为35 ℃,定性分析:本文按照多离子反应检测(MRM)结果来确定。

表2 苦涩味分析梯度洗脱程序Table 2 Gradient elution procedure for bitterness analysis

1.2.2.2 单宁含量的测定 单宁含量的测定:分光光度法[16]。称取果样1 g,用80 mL水洗入100 mL容量瓶,放入沸水浴中提取30 min,取出,冷却,定容,吸取1.0 mL提取液,分别加入5.0 mL水,1 mL钨酸钠-钼酸钠混合溶液和3.0 mL碳酸钠溶液,在765 nm波长下测定样品溶液的吸光度。回归方程:y=0.2987x-0.0172,相关系数r=0.9995。

1.3 数据分析

用Excel进行数据处理和制图,DPS进行相关性分析。

2 结果与分析

2.1 核桃果实外观及苦涩味相关指标变异情况

为了解所选核桃种质资源外观指标变异情况及苦涩味指标含量变异情况,对核桃果实外观指标及苦涩味指标含量的平均值、标准差、变异系数、最大值、最小值和多样性指数进行了分析,结果见表3。可以看出,不同外观指标及苦涩味指标含量的变异系数不同,外观指标中,其中果仁重的变异系数最大为53.686%,果形指数的变异系数最小为7.501%;苦涩味指标中,其中芦丁含量的变异系数最大为227.612%,儿茶素的变异系数最小为13.563%,从遗传多样性指数来看,外观指标中,多样性指数的范围在0.015～2.123,平均多样性指数为0.449。苦涩味指标中,多样性指数变动范围在 0.015～171.81之间,平均多样性指数为 25.065,芦丁的变异系数较高,但单宁的多样性指数较高。

表3 核桃果实外观及苦涩味品质性状变异比较(n=38)Table 3 Comparison of walnut fruit appearance and bitter taste quality character variation(n=38)

可见变异系数和遗传多样性在核桃果实外观及显苦涩味指标上表现得并不一致,说明核桃果实中芦丁变异性广泛,但其分布均匀度较低,果实中单宁含量变异程度较小,但其遗传丰富度较高。

2.2 核桃果实苦涩味指标的相关性

对核桃果实中苦涩味指标进行相关性分析(表4),结果表明,槲皮素与芦丁呈极显著正相关(P<0.01)相关性高达 73%,随着槲皮素含量增加芦丁含量增加;没食子酸与儿茶素、槲皮素呈显著性正相关(P<0.05),说明随着没食子酸含量增加儿茶素与槲皮素含量也随之增加;没食子酸与香草酸呈显著性负相关(P<0.05),说明随着没食子酸含量增加香草酸含量降低;单宁与儿茶素、没食子酸呈极显著正相关(P<0.01),说明随着单宁含量增加儿茶素与没食子酸含量随之增加。

表4 核桃果实中显苦涩味指标含量的相关性分析Table 4 Correlation analysis of bitter taste in walnut fruit

2.3 核桃果实苦涩味指标主成分分析

对38个核桃品种的7个苦涩味指标进行主成分分析,从表5可以看出,4个主成分的累积方差贡献率为 83.58%,基本包括了苦涩味指标的所有具有的信息,可将原来的7个苦涩味指标转化成4个主成分,第1主成分的特征值为2.4168,方差贡献率为34.53%,代表7个苦涩味指标的34.53%的信息;第2主成分的特征值为1.4749,方差贡献率为21.07%,方差累计贡献率为55.60%,第3主成分的特征值为1.1028,贡献率为15.75%，累计贡献率71.35%;第4主成分的特征值为0.8561,方差贡献率为12.23%,累计贡献率为83.58%。由表5可知,在第1 主成分主要是芦丁、槲皮素、没食子酸及单宁对苦涩味的贡献大;在第2主成分中起作用的芦丁、槲皮素,其中儿茶素、没食子酸、单宁为负值,说明儿茶素、没食子酸、单宁与第二主成分的影响为负相关;在第3主成分中起作用的为香草酸,绿原酸为负值,说明绿原酸对第三主成分的影响为负;在第4主成分中起作用的为香草酸和绿原酸。从主成分分析的结果可以看出核桃果肉中儿茶素、芦丁没食子酸等指标基本囊括了核桃苦涩味指标信息。

表5 核桃果实苦涩味指标含量主成分分析Table 5 Principal component analysis of bitter taste index content of walnut fruit

表6 38个核桃种质材料苦涩味指标均值Table 6 Mean bitter taste index of 38 walnut germplasm materials

2.4 核桃果实外观及苦涩味指标聚类分析

由图1可知,根据核桃外观指标及苦涩味指标含量,对38份核桃种质进行系统聚类(欧式距离,类平均法),在距离1197左右处,可将核桃种质分为4类,第Ⅲ类包含的核桃种质资源最多,有20 份资源,其次是第Ⅰ类有 16 份资源,第Ⅱ类和第Ⅳ类最少,仅一份资源为加州黑核桃1和南6-4。第Ⅰ类 16 份资源中,包括加州黑核桃2、3、4、5、7、8及中宁魁、中宁魁大、中宁行16、元丹等10份砧木用种质资源,中4-12,中3-16也在其中。第Ⅱ类中仅有 1 份加州黑核桃1,第Ⅲ类包括南半1-22、叶城150年、叶城170年等主要为常规栽培品种及其实生后代,第Ⅳ类中也仅有1份南6-4核桃自然实生后代种质,其单宁含量最高。

图1 核桃果实外观及显苦涩味指标含量聚类Fig.1 Cluster of the appearance and the component of bitter and astringent taste in walnut fruit

3 讨论与结论

涩味是口腔上皮细胞暴露在明矾或单宁溶液中,产生一种干燥、收敛、粗糙的复合感觉[17]。食品中未成熟的果实、坚果、茶及红酒等均具有涩感,具有涩味的化学物质主要有明矾类与多酚类[18]。

苦涩味来源于多酚类物质,高丽萍教授课题组研究证明,茶叶中多酚类物质主要是儿茶素,儿茶素分为单体儿茶素和酯型儿茶素,其中酯型儿茶素约占 70%,是影响茶叶苦涩味的主要成分[18]。2003年德国学者Scharbert等[19-20]发现酯型儿茶素是绿茶苦涩味的主体,苦味物质主要为咖啡碱和EGCG,芦丁(茶叶中的黄酮苷)自身没有明显的滋味,但有增强咖啡碱苦味的作用。茶叶的苦味成分主要包括生物碱、氨基酸、茶皂素、多酚类物质,其中黄烷醇类,黄烷酮类、黄酮醇类、花色素类等多酚类物质同时具有苦味和涩味[21]。乜兰春等[22]研究苹果果实酚类物质时发现绿原酸、儿茶素、表儿茶素和原花青素是引起苹果果实涩感的主要物质。

果实中的苦涩味物质经常影响其食用和加工品质,是果实风味的重要指标之一,引起果实涩味的主要物质也是单宁以及其他少数几种酚类物质,涩味物质有时可以增加果实口感,当涩味物质含量过多时,就会引起消费者的不适应[23-24]。新疆主要栽培核桃品种整体口感品质多年来很受各地经销商和消费者青睐,尤其以‘新温81’、‘新新2’、‘新温185’等品种为代表品种[25]。但是随着核桃栽培面积在全国各地不断扩大[26],核桃的消费量仍然没有明显上升,价格也呈一定下降趋势。虽然核桃果实富含多种保健营养成分,消费者人均消费核桃量还不是很多[27]。究其原由,主要受到了核桃果实所含苦涩味物质的影响,造成人们每次食用数量不多。

本研究结果显示,核桃果实品质性状变异丰富,表现出不同程度的遗传多样性。外观指标中果仁重、缝合线高度、出仁率的变异系数较大;显苦涩味指标中芦丁、槲皮素、香草酸的变异系数较大。外观指标中单果重、果仁重、平均三径的多样性指数较大;显苦涩味指标中单宁、绿原酸、没食子酸、儿茶素的多样性指数较大,充分反映了这些性状的遗传多样性及丰富程度,具有较为丰富的遗传信息和利用潜力。外观指标中果形指数变异系数较低,苦涩味指标中儿茶素的变异系数较低,反映其离散程度较低,性状遗传稳定。对来源不同的新疆核桃种质进行对比分析可知,砧木类型其苦涩味含量较低,栽培品种外观品质较优良。自然实生后代中发现南6-4单宁含量最高,而且综合聚类分析结果显示南6-4的遗传基础深厚、进化程度较低,该材料可能含有较多其它优良性状,可作为今后本地核桃砧木品质改良和新品种选育的亲本或中间材料。

基于苦涩味物质和综合外观的多样性聚类分析发现,引进加州黑核桃主要和部分取自温宿县核桃林场、温宿县核桃资源圃以及温宿县核桃林场的几个“中宁”品种及新疆本地自然实生后代核桃种质聚在一类,表明在苦涩物质成分方面,加州黑核桃和新疆本地核桃有相似之处。经该研究探索,发现苦涩品质方面,新疆阿克苏当地主栽品种比几个引进加州黑核桃和“中宁”核桃品种高,且变异幅度较大,为今后对新疆当地核桃种质苦涩味品质遗传改良工作铺垫了较好的种质材料空间,也为新疆当地核桃种质苦涩品质优化提供了可能性。