法舒地尔对变应性鼻炎小鼠鼻黏膜中Th1/Th2、Th17/Treg相关细胞因子的影响

张玉，韩佳利

（中国医科大学附属第一医院耳鼻咽喉科，沈阳 110001）

变应性鼻炎（allergic rhinitis，AR）是常见的上呼吸道慢性炎症［1］，常由环境抗原（尘螨、植物花粉和动物蛋白等）刺激导致，是以辅助性T细胞（T helper cell，Th ）2细胞因子优势表达、IgE 过度合成、嗜酸性粒细胞选择性浸润为特征的疾病。Th1/Th2［2］、Th17/调节性T细胞（regulatory T cell，Treg）［3］的免疫失衡是目前已知的变应性鼻炎发病的重要机制。Th1、Th2、Th17、Treg 均属于 CD4+T 细胞。干扰素γ（interferon γ，IFN-γ）、白细胞介素4（interlukin-4，IL-4）、IL-17、Foxp3 分别是 Th1、Th2、Th17、Treg 的主要效应因子［4］。AR研究已有数个世纪的历史，对其症状的控制越来越成熟，但彻底治愈AR仍是耳鼻咽喉科的难点问题。AR的发病机制、免疫调控网络体系和治疗方案仍在不断探索中。法舒地尔是Rho激酶抑制剂。已有研究［5-6］表明Rho激酶通过介导气道平滑肌收缩［7］、炎症细胞迁移［8］在哮喘［9］、AR［10］等慢性气道炎症疾病的发生过程中起重要作用［11］。Rho激酶抑制剂可有效抑制和逆转气道高反应性和气道重建，减轻变应性气道炎症和黏液分泌［12］。

本研究建立AR小鼠模型，选用盐酸法舒地尔作为治疗药物，观察小鼠鼻黏膜局部炎症反应，检测小鼠鼻黏膜中Th1/Th2、Th17/Treg分泌的代表性细胞因子 IFN-γ/IL-4、IF-17/Foxp3的mRNA表达情况，旨在探讨法舒地尔在AR中的作用及产生的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物、试剂及分组

6～8周龄C57小鼠24只（中国医科大学药理学实验室提供），雌雄各半，体质量18～22 g；试剂主要包括卵清蛋白（ovalbumin，OVA，美国Sigma公司）、AL（OH）3、盐酸法舒地尔（天津红日药业股份有限公司）。将小鼠随机分为AR组（AR小鼠未给予药物治疗，n=8）、法舒地尔组（AR小鼠给予法舒地尔治疗，n=8）、对照组（正常小鼠，n=8）。

1.2 AR小鼠模型建立

1.2.1 致敏阶段：将100 μg OVA与2 mg AL（OH）3溶于100 μL 生理盐水配制OVA溶液。AR组和法舒地尔组小鼠分别于模型建立0、3、7、10 d腹腔注射OVA溶液（100 μL）。正常对照组小鼠相同时间注射等量生理盐水。

1.2.2 激发阶段：将500 μg OVA溶于10 μL生理盐水配制OVA溶液。AR组和法舒地尔组小鼠于模型建立15～21 d OVA溶液滴鼻，每侧鼻孔10 μL，连续7 d。法舒地尔组小鼠每次OVA溶液滴鼻激发前0.5 h腹腔注射法舒地尔（10 mg/kg），连续7 d。正常对照组处理时间同法舒地尔组，药物均用等量生理盐水替代。

末次鼻腔致敏后30 min 内观察小鼠打喷嚏、挠鼻、抓脸、鼻溢等症状。记分标准［10］：（1）鼻痒，轻搔鼻 1～ 2 次，1 分；剧烈抓挠鼻面不止，3分；介于二者之间，2 分。（2）喷嚏，1～ 3 个，1 分；4～ 10 个，2 分；11 个以上，3 分。（3）流涕，流至前鼻孔，1 分；超出前鼻孔；2 分；涕流满面，3 分。以上各项指标均采用叠加量化记分法。总分＞5分表示AR模型建立成功。

1.3 组织切片及染色

各组选取2只小鼠于末次激发后2 h处死，然后取鼻黏膜投入4%多聚甲醛中固定，包埋成蜡块，蜡块切片（厚度5 μm）。HE染色，镜检观察。

1.4 实时荧光定量PCR

末次激发2 h后小鼠脱颈椎处死、断头。迅速打开鼻腔，取出鼻黏膜后立即投入液氮冻融。应用Trizol试剂提取小鼠鼻黏膜组织细胞总RNA，紫外分光光度计测定RNA的质量浓度及鉴定纯度。使用RT试剂盒将0.1 ng～5 μg总RNA逆转录成cDNA。使用ABI7500实时PCR检测。引物序列：IFN-γ，上游引物5’-ATGAACGCTACACACTGCATC-3’；下游引物5’-CCATCCTTTTGCCAGTTCCTC-3’。IL-4，上游引物5’-GGTCTCAACCCCCAGCTAGT-3’；下游引物5’-GCCGATGATCTCTCTCAAGTGAT-3’。IL-17，上游引物5’-TTTAACTCCCTTGGCGCAAAA-3’；下游引物5’-CTTTCCCTCCGCATTGACAC-3’。Foxp3，上游引物5’-CCCATCCCCAGGAGTCTTG-3’；下游引物5’-ACCATGACTAGGGGCACTGTA-3’。β-actin，上游引物5’-GGCTGTATTCCCCTCCATCG-3’；下游引物5’-CCAGTTGGTAACAATGCCATGT-3’。

1.5 统计学分析

采用GraphPad prism 6.0软件进行统计学分析，计量资料以表示，2组比较采用独立样本t检验，3组比较采用单因素方差分析（One-Way ANOVA），P＜ 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3组小鼠症状比较

结果显示，与对照组比较，AR组小鼠AR症状明显（P＜ 0.05）；与AR组比较，法舒地尔组AR症状明显减轻（P＜ 0.05），见表1。

2.2 各组小鼠鼻黏膜HE染色结果

光镜下结果显示，AR组黏膜可见明显肿胀及大量嗜酸性粒细胞浸润。与AR组比较，法舒地尔组鼻黏膜肿胀减轻，嗜酸性粒细胞浸润减少。而对照组未见黏膜肿胀及嗜酸性粒细胞浸润，见图1。

2.3 各组小鼠鼻黏膜中IFN-γ mRNA、IL-4 mRNA、IL-17 mRNA 及Foxp3 mRNA表达

结果显示，与对照组比较，AR组IL-4mRNA、IL-17mRNA表达明显升高，IFN-γmRNA、Foxp3mRNA表达明显降低，差异均有统计学意义（均P＜ 0.05）。与AR组比较，法舒地尔组IL-4mRNA表达明显降低，IFN-γmRNA、Foxp3mRNA、IL-17mRNA表达明显升高，差异均有统计学意义（均P＜ 0.05）。见表2。

表1 各组小鼠末次鼻腔致敏后30 min内过敏症状比较Tab.1 Comparison of allergic symptoms within 30 minutes after the last nasal sensitization in each group

图1 各组小鼠鼻黏膜HE染色结果×40Fig.1 HE staining results of the nasal mucosa in each group × 40

3 讨论

AR是由炎症细胞和免疫细胞参与的变态反应。针对某种变应原的特异性IgE［13］抗体是引起Ⅰ型超敏反应的主要因素。CD4+T细胞分泌的细胞因子调节IgE的表达［14］。

CD4+T细胞包括Th1、Th2、Th17、Treg等。其中Th2在过敏性疾病中起着关键作用［15］。Th1/Th2、Th17/Treg细胞失衡在AR患者的发病中发挥重要作用［16］。Th1、Th2、Th17、Treg及其代表性的细胞因子（IFN-γ、IL-4、IL-7）和转录因子Foxp3之间存在着相互调节关系［17］。本研究结果表明，与对照组比较，AR组IL-4mRNA、IL-17mRNA表达明显升高，IFN-γmRNA、Foxp3mRNA表达降低（均P＜ 0.05），与以往研究［18-19］结果一致。

Rho/ Rho激酶通路能够调节细胞骨架动力学，影响细胞迁移、运动［20］。Rho激酶抑制剂能阻碍巨噬细胞功能［21］。阻断Rho激酶2活性可显著抑制炎症黏膜中的促炎性细胞因子［22］。本研究发现法舒地尔能够抑制AR小鼠鼻黏膜的炎症反应，猜测可能是由于Rho激酶抑制剂抑制免疫细胞迁移、趋化并对免疫反应进行调节，减少了AR小鼠鼻黏膜中嗜酸性粒细胞浸润所致，与以往研究［23］结果一致。

表2 各组小鼠鼻黏膜中IFN-γ mRNA、IL-4 mRNA、IL-17 mRNA 及Foxp3 mRNA的表达Tab.2 Expression of IFN-γ mRNA，IL-4 mRNA，IL-17 mRNA and Foxp3 mRNA in the nasal mucosa of mice in each group

Rho激酶上游信号Rho-GDP酶激活认为是免疫反应协调的关键事件，阻断Rho激酶2活性能抑制CD4+T细胞分化为Th1和Th17细胞，促进了Treg细胞分化［22］。法舒地尔处理过的小胶质细胞能够显著上调Treg细胞［24］。本研究结果表明法舒地尔对AR小鼠鼻黏膜免疫细胞的细胞因子表达水平均有影响，IL-4表达明显降低，IFN-γ、Foxp3表达明显升高。但本研究中法舒地尔治疗后IL-17mRNA 表达水平却异常升高，造成结果差异性的原因考虑可能和Th17的引物有关。

综上所述，法舒地尔能减轻AR小鼠鼻黏膜的炎症反应，明显降低IL-4表达水平，升高IFN-γ、Foxp3的表达水平，改善鼻黏膜局部Th1/Th2、Th17/Treg免疫失衡。但对于IL-17的影响趋势有待于进一步研究证实。