利用CRISPR/Cas9 技术建立PTEN敲除的人子宫内膜腺癌细胞模型及其功能研究

李宇恒，邓诚思，关爱伟，宋晓宇，冯艳玲，关奕，曹流

（中国医科大学转化医学研究院，沈阳 110122）

张力蛋白同源的第 10 号染色体缺失的磷酸酶（phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten，PTEN）是一个具有双重特异性磷酸酶活性的抑癌基因。PTEN通过调控过磷脂酰肌醇 3 激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，Pl3K）/蛋白激酶 B（protein kinase B，PKB）和丝裂原激活蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信号通路的平衡，参与细胞凋亡、细胞周期阻滞、细胞迁移等信号通路，发挥其抑癌功能［1］。PTEN表达的缺失可见于多种肿瘤，可能与癌症的进展和转移有关［2］。

常间回文重复序列丛集/常间回文重复序列丛集关联蛋白9（clustered regulatory interspaced short palindromic repeat/Cas9，CRISPR/Cas9）系统是一种在小向导RNA（small guide RNA，sgRNA）的指导下在基因组水平上对目的基因DNA序列进行改造的定点编辑技术，可实现目的基因的完全敲除。自目标设计始，基因修饰可在1～2周内完成，修饰的克隆细胞株可在2～3周内获得［3］。CRISPR/Cas9因其高效率和高精度得到了广泛的关注。本研究拟利用CRISPR/Cas9 系统建立PTEN基因靶向敲除细胞株，探讨PTEN对子宫内膜癌细胞生物学功能的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞培养和主要试剂

1.1.1 细胞培养：用含10%胎牛血清（中国Clark公司）、1%青霉素和链霉素（中国GENVIEW公司）的DMEM培养基（德国BI公司），在37 ℃、5%CO2培养箱内培养人子宫内膜腺癌细胞株KLE（美国ATCC公司），细胞呈贴壁生长。

1.1.2 主要试剂：DL2000 DNA Marker（日本TaKaRa公司），BBSⅠ酶（美国Sigma公司），T4 DNA连接酶（美国Sigma公司），DH5α感受态E.coli（日本TaKaRa公司），PrimeSTAR GXL DNA Polymeres PCR试剂盒（日本TaKaRa公司），Promega DNA纯化试剂盒（美国CST公司），质粒提取试剂盒（中国TIANGEN公司），Biobest转染试剂（美国CST公司），PTEN、LC3、P62抗体（美国CST公司），CCK-8（美国Bimake公司）。

1.2 puro-cas9-PTEN-sgRNA质粒构建

1.2.1 sgRNA的设计与合成：根据sgRNA设计网站（http：//tools.genome-engineering.org），对PTEN基因1个外显子序列进行分析，筛选出评分较高的sgRNA序列（靶点序列sgRNA1，5’-caccgTTGAGAGTTGAG CCGCTGTG-3’；sgRNA2，5’-caccgTCATGGCTGCAG CTTCCGAG-3’），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2.2 sgRNA的磷酸化与退火：磷酸化体系包含100 μmol/L Oligo-gRNA-F 1 μL，100 μmol/L Oligo-gRNA-R 1 μL，10×kinase buffer A 1 μL，100 mmol/L ATP 0.5 μL，T4 PNK 0.5 μL，ddH2O 6 μL，共10 μL体系，置于37 ℃30 min。退火条件95 ℃5 min，75 ℃5 min，55℃5 min，35 ℃5 min。获得双链gRNA。

1.2.3 sgRNA载体构建：将双链gRNA与BBSⅠ酶切纯化后的载体混合（质量比1 ∶3）连接。T4 DNA连接酶 16 ℃连接 16 h。取连接产物，DH5α感受态E.coli转化，用氨苄抗性筛选阳性克隆，挑取单克隆后摇菌，取菌液送生工生物测序，确定质粒构建成功。

1.3 构建PTEN稳定敲除的人子宫内膜癌细胞株

1.3.1 人子宫内膜癌细胞KLE的转染以及加药筛选：接种KLE细胞至6 cm培养皿中，37 ℃培养24 h后，按照说明书用Biobest转染试剂共转染puro-cas9-PTEN-sgRNA1和puro-cas9-PTEN-sgRNA2。4～6 h后换为10%细胞培养液培养，72 h后传代并将培液换成带有嘌呤霉素（1 μg/mL）的10%DMEM 培养基筛选，5 d后，细胞稀释接种于96孔板中，筛选单克隆继续扩大培养。

1.3.2PTEN稳定敲除细胞株的鉴定：（1）根据美国国家生物技术信息中心数据库PTEN基因组的序列以及sgRNA切点的位置设计引物（F，CTGGAGCGG GGGGGAGAAGC；R，TCAGACTTTTGTAATTTGTG），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。（2）提取单克隆细胞株的DNA，以DNA为模板，利用合成的引物进行PCR，PCR反应体系包括DNA 200 ng，5×PrimeSTAR buffer 10 μL，dNTP（2.5 mmol/L）4 μL，Primer-F（10 μmol/L）1 μL，Primer-R（10 μmol/L）1 μL，PrimeSTAR GXL DNA polymeres 0.5 μL，加ddH2O至50 μL 。PCR反应条件如下，98 ℃ 5min；98 ℃ 20 s，56 ℃ 20 s，72 ℃ 60 s，35个循环；72 ℃ 7 min；4 ℃10 min。（3）通过酚氯仿-异戊醇/乙醇沉淀方法纯化获得的目的基因，取40 μL PCR产物，加入160 μL 1×TE buffer（pH8.0）混匀后，加入酚氯仿-异戊醇 200 μL，剧烈震荡，离心（14 000 r/min）20 min，取上清，加入20 μL 3 mol/L醋酸钠、400 μL无水乙醇混匀后，离心（14 000 r/min）15 min，弃上清，加500 μL 70%乙醇混匀，离心（14 000 r/min）15 min，弃上清，加18 μL ddH2O溶解纯化产物。（4）取纯化产物加2 μL NEB2 buffer退火（75 ℃5min，55 ℃5 min，35 ℃5 min，20 ℃5 min），退火产物加0.5 μL T7E1，于37 ℃酶切1 h，用2%琼脂糖凝胶电泳分离观察酶切情况。

1.4 Western blotting

将经筛选获得的细胞系扩大培养后，收集对照野生型子宫内膜腺癌细胞和PTEN敲除的KO细胞，用RIPA细胞裂解缓冲液提取总蛋白，BCA 蛋白试剂盒定量。行SDS-PAGE 电泳并将蛋白转移到PVDF 膜上，5%脱脂牛奶室温封闭 1 h，4 ℃摇床孵育PTEN、tubulin、P62、LC3 抗体过夜，PBST 缓冲液洗膜 3 次（10 min/次），二抗室温孵育 1 h，PBST 缓冲液洗膜 3次（10 min/次），显影检测。

1.5 CCK-8细胞活性检测

于48孔培养板中接种细胞悬液（50 000/孔），培养24 h后，每孔加入20 μL CCK-8溶液。培养箱内孵育2 h，酶标仪测定450 nm的吸光度值。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 sgRNA设计结果

在NCBI数据库获取人源PTEN的cDNA，根据实验目的选择目标外显子，通过网站（http：//tools.genome-engineering.org）设计并预测sgRNA效率，并初步选择出得分最高的sgRNA。见图1。

图1 PTEN基因sgRNA设计示意Fig.1 Design of PTEN gene sgRNA

2.2 T7E1酶切实验结果

T7E1酶切实验结果表明，CRISPR/Cas9系统对KLE细胞基因组中的PTEN切割成功。见图2。

图2 T7E1酶切实验结果Fig.2 Results of T7E1 enzyme digestion

2.3 等位基因敲除后蛋白表达情况

Western blotting结果显示，进行基因敲除的细胞系PTEN蛋白表达量明显降低，进一步证明了基因敲除成功。见图3。

2.4 自噬相关因子LC3、P62蛋白的表达水平

Western blotting结果显示，PTEN敲除后，细胞内自噬相关因子P62的表达增加，LC3Ⅰ型向Ⅱ型的转化减少，提示细胞自噬受到抑制。见图3。

图3 PTEN敲除后细胞内PTEN和自噬相关因子检测Fig.3 Detection of intracellular PTEN and autophagy related factors after PTEN knockout

2.5 CCK-8细胞活性检测

CCK-8细胞活性检测结果显示，PTEN敲除的子宫内膜腺癌细胞活性高于对照组野生型子宫内膜腺癌细胞，PTEN敲除的细胞增殖明显加快，差异有统计学意义（P＜ 0.05）。见图4。

图4 CCK-8细胞活性检测结果Fig.4 Results of CCK-8

3 讨论

本研究利用CRISPR/Cas9 技术成功构建了PTEN敲除的人子宫内膜腺癌细胞模型。CRISPR/Cas9 基因编辑系统作为第三代基因编辑技术，促进基因组中特定位点的靶向DNA发生双链断裂后，通过非同源性末端接合或同源介导修复方式刺激基因组重新编辑，实现单个基因、位点的特异性突变，从而使特定基因完全丧失生物学功能［4-5］。与锌指蛋白、转录激活因子样效应因子核酸酶技术相比，CRISPR/Cas9的优势在于易操作、效率高、周期短、工作量小、成本低［6-9］。但CRISPR/Cas9 技术也存在一定限制，即Cas9通过sgRNA上的20-nt引导序列定位于特定的基因组位点，在靶标上具有作用范围，同时也具有潜在的脱靶突变［10-11］。本研究设计并选取了多个sgRNA序列，经过验证最终确定了最佳sgRNA序列。此外，由于CRISPR/Cas9 质粒需要表达的 Cas9 蛋白较其他载体大，且具有一定的细胞毒性［12］，对转染及后续的筛选和单克隆培养造成了一定的困难，导致实验周期长于预期。

PTEN是人类癌症中最常见的突变抑癌基因之一，在乳腺癌、前列腺癌、子宫内膜癌、胶质母细胞瘤等多种人类癌症中均可见突变［13］。细胞自噬是一种重要的细胞学功能，在正常的生理过程中起着“管家”的作用，细胞通过自噬行为清除受损的细胞器和错误折叠的蛋白质，从而参与生长和衰老的调控。自噬调节的缺陷在许多疾病中起重要作用，包括癌症、神经退行性疾病、病原体感染和代谢性疾病。本研究发现，在人子宫内膜腺癌细胞中敲除PTEN明显抑制了细胞自噬，并介导了人子宫内膜腺癌细胞增殖加快。

综上所述，本研究发现，PTEN的敲除使子宫内膜腺癌细胞自噬受到抑制，导致癌细胞增殖加快。因此，探讨PTEN缺失导致的细胞自噬异常，对于子宫内膜癌的研究与治疗具有重要的意义。