实验教学用芽孢和鞭毛标本制备的讨论

蔺 萌 王亚婷 胡 军 苗义艳 雷宁静

（郑州大学基础医学院 河南·郑州 450001）

医学微生物学实验是基础医学教育中的一门重要实验课程，是医学各专业的必修课程，要求医学生掌握无菌操作和实践培养。[1]在实验教学过程中，细菌的特殊结构教学观察主要是示教标本观察。芽孢和鞭毛属于细菌的特殊结构，标本制备可选用的菌种很多，本实验室主要使用的是破伤风梭菌。破伤风梭菌属于革兰氏染色阳性厌氧菌，能形成芽孢，有鞭毛，主要分布于土壤、人和动物的肠道，是一种历史悠久的梭状芽胞杆菌。[2-3]本文主要对本实验室的芽孢和鞭毛标本制备过程进行总结，探讨其它符合实验教学要求的菌种来源，并讨论这种标本制备方法是否能作为一项新的实验内容应用到实验教学过程中。

1 材料与方法

1.1 材料

（1）破伤风梭菌菌种，地表10cm 以下土壤；营养琼脂等。（2）95%乙醇，石碳酸复红液，碱性美蓝染液，饱和钾明矾染液，碱性复红乙醇饱和液等。（3）厌氧培养箱，无菌操作台等。

1.2 方法

（1）菌种培养。复苏破伤风梭菌菌种，取菌液进行三区划线，厌氧培养24h，作为1 代，再选取平板中个体较大、中心密边缘疏松的菌落，再次三区划线培养24h，作为2 代，以此类推，传代3 代以上增强细菌的活力。

（2）土壤中分离菌种。随机取地表10cm 以下土壤5-10g，加入300mL生理盐水，煮沸20min，冷却至室温，取上清液三区划线，37℃厌氧培养72h，选取平板中个体较大、中心密边缘疏松的单菌落，革兰染色鉴定确认为阳性菌，菌体芽孢呈鼓槌状，位于菌体一端，为破伤风梭菌。菌落接种于肉汤培养基中，37℃培养24h 增菌。传代至5-7 代以增强细菌的活力。

（3）芽孢染色。在载玻片中央滴加1 滴蒸馏水（约50 L），挑取传菌3 代培养≥72h 的单菌落，按常规方法进行涂片、干燥、固定，加石碳酸复红液，持续5min 微火加热并随时滴加染液，水洗，95%乙醇脱色至脱不下红色为止准，水洗，滴加碱性美蓝染液染色1min，滤纸吸干，显微镜下观察到芽孢结构。[4]

（4）鞭毛染色。提前将饱和钾明矾染液200mL、5%石碳酸50mL、20%鞣酸液20mL 混合，加入碱性复红乙醇饱和液10mL，混合后滤纸过滤（染色前再次过滤）。在载玻片中心靠一端的位置滴加2 滴蒸馏水（约100 L），挑取传菌≥7 代培养16h 的单菌落，37℃静置5min 使玻片始终处于湿润状态，倾斜玻片使液体从另一端缓慢流下，用滤纸吸去多余菌液，室温干燥，滴加染液染色5min，水洗，滤纸吸干，显微镜下观察到鞭毛结构。[5]

（5）高压灭菌处理。所用土壤、菌液、平板、滤纸等物品在标本制备完成后均经过高压灭菌处理。

2 结果

2.1 两种来源的破伤风梭菌芽孢染色标本

由保存菌种制备的芽孢标本中，芽胞呈圆形，芽孢位于菌体的一端，直径比菌体粗，使菌体呈鼓槌状（图1-A）；由土壤中分离的菌种制备的芽孢标本中，菌体呈鼓槌状，芽胞呈圆形位于菌体的一端，与保存菌种制备的芽孢标本形态特征相同（图1-B）。

图1 两种来源的破伤风梭菌芽孢染色(×1000)

2.2 两种来源的破伤风梭菌鞭毛染色标本

由保存菌种制备的鞭毛标本中，鞭毛分布于菌体四周（图2-A）；由土壤中分离的菌种制备的鞭毛标本中，鞭毛同样分布于菌体四周，与保存菌种制备的鞭毛标本形态特征相似（图2-B）。

图2 两种来源的破伤风梭菌鞭毛染色(×400)

3 讨论

破伤风梭菌属于厌氧性细菌中的厌氧芽孢梭菌属，是破伤风的病原菌，在窄而深的伤口、有异物污染、大面积创伤、烧伤或同时有其它需氧菌或兼性厌氧菌混合感染，均易造成厌氧环境，导致菌体侵入人体，发芽繁殖而致病，是破伤风梭菌感染的重要条件。[6]除创伤感染外，分娩时断脐不洁，手术器械灭菌不严等，均可引起发病。[7-8]

医学微生物学实验教学中，对破伤风梭菌的观察一般是观察芽孢形态，因其周身有鞭毛，也可作为鞭毛标本观察的菌种。破伤风梭菌的芽孢呈鼓槌装，鞭毛分布于菌体四周。芽孢和鞭毛标本制备是一项常规的实验技术。[9-10]本实验室所用的菌种主要是破伤风梭菌菌种。破伤风梭菌营养要求不高，在琼脂培养基上培养24-48h，可形成不规则的菌落，中心密周边疏，直径1mm 以上。[11]为了增加实验操作的趣味性和可操作性，本文对比了已保存菌种和土壤中分离的破伤风梭菌制备的芽孢和鞭毛标本，结果显示两种来源的菌种制备出来的标本形态结构相同，具有破伤风梭菌芽孢和鞭毛的特征性，因此，从土壤中分离破伤风梭菌可以作为一种新的菌种来源应用到实验教学标本制备过程中。实验材料来源于土壤，容易获取，操作容易，可重复性高，在制备的芽孢和鞭毛标本中，菌体形态完整，芽孢特征明显，鞭毛排列相对整齐，颜色对比度大，实验教学过程中便于观察。同时，可以结合实验教学内容，选择土壤中不同菌种进行分离纯化，增加实验的多样性。也可分析土壤中不同种类芽孢的数量比例，观察不同芽孢结构，分析土壤中可能存在的菌种种类，结合当地环境条件分析土壤中菌种对环境的影响等。

总之，微生物学是一门实践性很强的学科，实验课程在微生物学教学中发挥了非常重要的作用。为了培养学生的动手能力，应不断改进医学微生物学实验教学内容和方法。而本实验室采用从土壤中分离破伤风梭菌并制备芽孢和鞭毛标本的实验方法既可以增加标本制备的菌种来源，也可以作为一项新的实验设计内容应用到实验教学中。