枸杞多糖对2 型糖尿病大鼠胰岛素抵抗及其骨骼肌中GLUT4 表达的影响

白桂荣， 罗 丽， 谢晓敏， 韩 晶， 姚雪松

（1.宁夏银川市第一人民医院内分泌科，银川 750000； 2.宁夏中卫市第二人民医院，中卫 755000；3.宁夏中卫市人民医院，中卫 755000）

糖尿病（diabetes mellitus，DM）是一种遗传和多环境因素共同参与并相互作用的多基因多环境复杂病[1-2]。葡萄糖转运蛋白4（glucose transporter 4，GLUT4）是维持人体血糖平稳的关键作用物质。枸杞多糖（lycium barbarum polysaccharide，LBP）是近年来关注度较高、生物活性较强的大分子复合物，具有抗氧化、抗炎、降血糖、调血脂、增强免疫力等多重生物学效应。本研究通过观察LBP 对2 型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）大鼠的胰岛素抵抗以及骨骼肌中GLUT4表达的影响，探讨其与T2DM 的关系。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

LBP（银川市泰丰生物科技有限公司，宁夏）；链脲佐菌素（Sigma-Aldrich 公司，美国）；普通饲料（总热量16.20 kJ·g-1）、高脂饲料（总热量19.93 kJ·g-1，组成：普通饲料55%、绵白糖27%、猪油16%、蛋黄粉2%）均由宁夏医科大学实验动物中心提供；GLUT 4 兔抗大鼠一抗（博士德生物工程有限公司，武汉）；生物素标记的羊抗兔二抗及DAB 试剂盒（博奥森生物技术有限公司，北京）；血糖仪（强生公司，美国）。

1.2 方法

选择健康雄性SD 大鼠60 只，8 周龄，体质量180~220 g，均置于相同环境及条件下喂养，每笼5 只。控制相对湿度在55%~65%，温度控制在18 ℃~22 ℃。笼具及实验所需水、食料均经灭菌处理，并容许自由进食及饮水。SD 大鼠给予普通饲料喂养及高脂饲料喂养各1 周，2 周后禁食10 h，随机分为A、B、C 三组（各20 只），其中A、B 两组大鼠经腹腔一次性注射35 mg·kg-12%链脲佐菌素建模，72 h 后尾静脉采血测定血糖值，若随机血糖≥16.7 mol·L-1，且大鼠进食量、进水量及尿量增加，则确认T2DM 大鼠模型已成功构建；若随机血糖<16.7 mol·L-1则予以剔除，并及时补充。C 组为正常对照组，予以腹腔一次性注射等量的枸橼酸钠缓冲液[3]，随后A 组（T2DM+LBP）大鼠给予120 mg·（kg·d）-1LBP 灌胃[4]；B 组（T2DM+生理盐水）及C 组（NC+生理盐水）大鼠分别给予相同剂量生理盐水灌胃。实验周期为8 周。

1.3 观察及指标检测

1.3.1 一般情况观察 观察大鼠精神、活动、进食等一般状况；记录给药前及给药8 周时空腹血糖（FBG）、空腹胰岛素（FINS）等指标，计算胰岛素敏感指数（HOMA-ISI）、胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）；HOMA-IR=（FBG× FINS）/22.5；胰岛β 细胞功能（HOMA-β）＝20×FINS/（FBG-3.5）；应用免疫组化SABC 法检测给药8 周后大鼠骨骼肌中GLUT4 表达情况。

1.3.2 标本收集 给药8 周后测定空腹血糖及体质量之后，所有实验大鼠均给予麻醉（10%水合氯醛，1.0 mL/100 g）；麻醉后心脏取血，分离血清后冻存备测FINS。多聚甲醛灌注后取腓肠肌固定备测。

1.3.3 标本测定 （1）空腹血糖：采用试纸法检测。（2）FINS：采用放射免疫双抗体法测定。（3）骨骼肌中GLUT 4 表达测定：多聚甲醛固定后的腓肠肌，切成约5 mm×5 mm×5 mm，石蜡包埋，制成石蜡标本，切片厚度为4 μm，做GLUT4 表达 免疫组化染色。免疫组化染色采用SABC 法，一抗为GLUT4 兔多克隆抗体（即用型）。在高倍镜视野（×400）下观察骨骼肌中GLUT4 表达，对每张切片测5 个视野，进行细胞计数，若细胞质、细胞膜染色为棕黄色颗粒则判定为阳性。评分方法[5]：无色为阴性（-），0 分；浅黄色为弱阳性（+），1 分；黄色为中等阳性（++），2 分；褐色为强阳性（+++），3 分；将细胞计数得分与染色评分相乘即为综合得分，＜1.0 为弱阳性；1.0~1.5 为中等阳性；＞1.5为强阳性。

1.4 统计学方法

实验数据采用SPSS 17.0 软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用SNK-q检验。P≤0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况

实验结束时，A 组大鼠死亡4 只，B 组死亡7只，C 组死亡2 只。三组实验大鼠造模前精神、进食、活动等一般状况均良好，三组间大鼠体质量差异无统计学意义（P>0.05）；A、B 两组大鼠造模成功后均出现精神不振、毛质干枯凌乱、行动迟缓、多饮、多尿、多食等症状，A、B 两组大鼠体质量差异无统计学意义（P>0.05），与C 组同期相比体质量下降（P<0.05）；给药后4 周，A 组大鼠毛发逐渐出现光泽，“三多”症状有所缓解，B 组大鼠较前消瘦，毛色杂乱不佳，“三多”症状明显；给药后8 周，A 组大鼠一般状况良好，体质量增加，活动较活跃；B 组大鼠消瘦明显，精神状况不佳，“三多”症状仍明显，行动迟缓；C 组大鼠实验全程一般情况良好，体质量无明显变化（P>0.05）；给药8 周后三组间体质量比较，C 组>A 组>B 组（P<0.05）。见表1。

2.2 FBG、FINS、HOMA-IR、HOMA-ISI 水平

造模前各组间FBG 差异无统计学意义（P>0.05）；A、B 两组造模后FBG 均高于C 组（P均<0.05）；A 组给药后8 周FBG、FINS 较给药前降低（P均<0.05）；给药8 周后FBG、FINS、HOMA-IR 比较：B组>A 组>C 组，HOMA-ISI：C 组>A 组>B 组（P均<0.05），见表1。

2.3 骨骼肌组织中GLUT4 表达情况

给药8 周后检测大鼠骨骼肌中GLUT4 表达情况（见表1、图1）。三组大鼠骨骼肌GLUT4 表达：C 组>A 组>B 组（P均<0.05）。

3 讨论

胰岛素增敏和改善胰岛素抵抗是T2DM 治疗的重要原则。GLUT4 具有胰岛素增敏的作用，本研究构建大鼠糖尿病模型，并予以LBP 治疗，结果表明，LBP 可促进T2DM 大鼠骨骼肌中GLIUT4 的表达、改善胰岛素抵抗，从而控制血糖。

表1 三组大鼠FBG、FINS、HOMA-IR、HOMA-ISI 及GLUT4 表达比较

研究证实，GLIUT4 的表达降低以及转位受损致使机体对葡萄糖的摄取和利用减少，从而导致糖代谢失衡。因此，如何增加GLUT4 的数量和活性是目前所关注的焦点。邝秀英等[6]发现二甲双胍可以增强T2DM 大鼠骨骼肌中GLUT4 的表达，从而提高机体对胰岛素的敏感性以及改善高血糖状态。于乐等[7]发现附子多糖对T2DM 大鼠GLUT4 的表达无影响，但可促进GLIUT4 向细胞膜上转位。Chen 等[8]对胰岛素抵抗女性患者的脂肪组织进行检测，发现GLUT4 随着胰岛素抵抗的改善而降低，因此认为GLUT4 对胰岛素具有增敏作用。Atkinson 等[9]研究发现GLUT4 随着胰岛素抵抗的削弱而降低。本研究中，A 组大鼠骨骼肌中的GLUT4 表达水平较正常大鼠下降，GLUT4 表达量不足，使其成为糖代谢重要的限速步骤，阻碍了糖的转运，进而导致糖尿病的发生。

研究证实，LBP 具有调节糖脂代谢紊乱、对抗氧化应激、增强机体免疫以及对抗辐射损伤等多重作用[10]。本研究表明，给予健康成年雄性SD大鼠高脂高热卡饲料饲养，继而一次性给予腹腔内注射链脲佐菌素可成功构建T2DM 模型。用LBP 治疗T2DM 大鼠，可见其精神、进食、活动等一般状况逐渐好转，给药后4 周，经LBP 治疗的糖尿病大鼠毛发逐渐出现光泽，“三多”症状明显改善。给药后8 周，A 组一般情况明显好转，较为活跃，体质量较给药前增高。而B 组消瘦明显，证明LBP 可改善糖尿病症状。A 组大鼠FBG 低于B组，且HOMA-IR 及HOMA-ISI 较B 组好转，说明LBP 有降低血糖作用，且可改善胰岛素抵抗。

LBP 是枸杞中最主要的活性成分，但其降血糖机制仍未明确。GLUT4 是人体将葡萄糖移出循环系统的主要转运载体，是维持人体血糖平稳的关键作用物质之一。GLUT4 表达的调节在基因水平以及蛋白质水平均可发生。当机体接受胰岛素的刺激后，继而引发胞浆内的“GLUT4 囊泡”向外转位并使其与细胞膜融合，从而增加葡萄糖摄取和利用。本研究结果表明，T2DM 模型大鼠中GLUT4 水平下降，说明GLUT4 的表达在基因转录的水平受到抑制，给予LBP 治疗后可使模型大鼠骨骼肌中GLUT4 水平升高，从而进一步增强机体对胰岛素的反应性及敏感性。本研究中，LBP 改善胰岛素抵抗的可能机制为：①LBP 引起GLUT4向细胞表面移位，进而刺激葡萄糖摄取[11]。②LBP通过纠正糖、脂代谢紊乱，增加糖代谢和胰岛素分泌，减轻胰岛β 细胞的信号转导障碍，从而发挥降低血糖的作用。③LBP 对胰腺β 细胞有一定的保护作用，LBP 可改善T2DM 患者胰岛素敏感性。

综上所述，LBP 可促进骨骼肌组织中GLUT4的表达，可增加机体对胰岛素的反应性及敏感性并改善胰岛素抵抗。